无须离心微孔板凝聚胺抗体筛查法及其应用.docVIP

无须离心微孔板凝聚胺抗体筛查法及其应用[摘要] 目的：建立一种简便、快速的无须离心的微孔板凝聚胺抗体筛查方法。方法：将传统的试管凝聚胺法进行改进，采用自制的微孔板代替传统的试管，省却离心等步骤进行不规则抗体筛查。结果：将无须离心的微孔板凝聚胺法同传统的试管凝聚胺法及抗球蛋白法进行比较，无须离心的微孔板凝聚胺法与试管凝聚胺法检测抗-D、抗-E灵敏度无差异，都高于抗球蛋白法，无须离心的微孔板凝聚胺法抗-C稍低于试管凝聚胺法（1:256 1:512），与抗球蛋白法相同；输血前筛查150份标本，同时发现2例不规则抗体，分别为抗-D及抗-M；对以前鉴定的11例不规则抗体，两者都漏检了抗-Jka，其他完全一致。结论：无须离心的微孔板凝聚胺法无须试管及离心设备，具有简便快速、经济有效等特点，是一种可行的抗体筛查方法。 [关键词] 凝聚胺；抗体筛查；微孔板 [中图分类号]R446 [文献标识码]B[文章编号]1673-7210（2007）08（b）-105-03 血型免疫抗体在正常人群中检出率为0.3%~2%，是引起迟发性免疫性输血反应的主要原因[1]。我国《临床输血技术规范》规定：凡遇到交叉配血不合，有输血史、妊娠史或短期内需要多次输血的患者必须作抗体筛选试验。美国血库协会（AABB）规定：凡是输注全血及红细胞的患者都必须进行不规则抗体筛选[2]。为了保证输血安全，提高输血疗效，减少或杜绝溶血性输血反应的发生，对献血者及患者进行不规则抗体筛选具有重要的临床意义。 目前进行抗体筛选常用的方法主要有以下几种：试管凝聚胺法、抗球蛋白法和微柱凝胶法，其中抗球蛋白法由于操作烦琐、费时，难以作为日常抗体筛选的常规方法，尤其难以进行大批量检测；微柱凝胶法由于价格昂贵，目前国内经济上难以承受；而凝聚胺试管法具有操作简便、快速、灵敏度高等优点。Marie Lin[3]建立了一种无须离心的玻片凝聚胺法交叉配血，笔者在实验过程中发现，采用玻片法混匀样品时，样品很容易溢出玻片，导致检测失败，经常需要重复检测，而且很容易造成污染。本研究在玻片凝聚胺法的基础上进一步改进，采用自制的5×10微孔板，建立了一种无须离心的微孔板凝聚胺法进行抗体筛选，该方法保持了传统凝聚胺试管法的优点，同时省却了离心，适合大批量操作，现报道如下： 1 材料与方法 1.1 材料 凝聚胺试剂盒（台湾贝索产品）；不规则抗体筛选细胞和鉴定细胞(上海生物医药有限责任公司)；抗球蛋白试剂、抗-D、抗-E、抗-C（英格兰诊断试剂公司）；5×10微孔板（见图1）委托开元塑胶公司制备；细胞洗涤离心机为日本KUBOTA产品。 低离子介质液、10% Polybrene贮存液（Polybrene，Sigma公司，美国），根据Lalezari P和Jiang[4]介绍的方法配置。 重悬液主要成分由60 ml的0.4 mol/L枸橼酸钠与40 ml的5%的葡萄糖混合而成。 1.2 方法 无须离心的微孔板凝聚胺法分为三个阶段： 致敏阶段：标记好微孔板，每行设计1个阳性对照，1个阴性对照。每孔分别加入2滴待检血清或标准血清，1滴10%的标准红细胞或待检红细胞，然后加入3滴低离子介质液，手工混合，室温放置1 min。 凝集阶段：每孔加入1滴0.1%Polybrene工作液，手工振荡混合，或者采用振荡仪混合2 min，可见所有的标本都出现凝集。 重悬阶段：加入1滴重悬液，手工轻轻振荡混合，或者采用振荡仪混合30 s，至阴性对照非特异性凝聚消失。 试管凝聚胺方法按照试剂盒说明书操作。 抗球蛋白法按照《中国输血技术操作规程（血站部分）》执行。 2 结果 2.1 致敏阶段结果（图2） 由图2可见，被稀释的血清与红细胞混匀，红细胞抗原与抗体充分反应。 2.2 凝集阶段结果（图3） 由图3可见，在凝聚胺的作用下，所有孔中的红细胞聚集在一起，形成肉眼可见的凝集。 2.3 重悬阶段结果（图4） 由图4可见，阳性对照红细胞凝集，阴性对照红细胞凝集散开。滴度分析检测标本中，随着血清稀释度的增加，红细胞凝集强度逐渐减弱。 2.4灵敏度检测 无须离心的微孔板凝聚胺法同试管凝聚胺法及抗球蛋白法灵敏度比较（表1）。 由表1可见，凝聚胺法优于抗球蛋白。 2.5输血前检查 我们对送检的150个交叉配血标本同时采用试管及无须离心的微孔板凝聚胺法进行抗体筛选，共发现两名患者血清中存在不规则抗体，分别为抗-D和抗-M，两者的结果完全一致。 2.6抗体鉴定 我们对已经鉴定的11例抗体标本同时采用试管及无须离心的微孔板凝聚胺法检测（表2），抗-Jka两种方法都没有检测出来，无须离心的微孔