木犀草素体内抗炎作用机制研究.doc

　　木犀草素体内抗炎作用机制研究 ：张毅，王旭光，杨展，何惠娟 【摘要】 目的 探讨木犀草素(Lut)的体内抗炎疗效及作用机制。方法 采用角叉菜胶致大鼠足爪肿胀模型，观察Lut对足爪肿胀度的影响；酶免疫测定法( EIA)测定炎足足跖部的渗出液前列腺素E2（PGE2）的含量；免疫组织化学法(IHC)及免疫印迹(ethods The model of carrageenaninduced edema of rat hind paa model ethasone (for a positive control). The PGE2 content in the edema exudate easured by EIA. The COX2 expression of the edema pamunohistochemistry and a pamatory effect on rat inflammation induced by carrageenan probably through the mechanisms of the inhibition of COX2 protein expression and of PGE2 production. 　　Key mation；prostaglandin E2 　　木犀草素(Luteolin，Lut)属于黄酮类化合物，主要存在于菊花、忍冬花、紫苏叶等天然药物，近年研究表明Lut具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等作用［12］。我们研究发现Lut在体外能抑制环氧合酶2(COX2) mRNA及蛋白表达，同时降低NFκB的DNA结合活性和蛋白表达［3］，其抗炎机制可能与此有关。为进一步探讨Lut的抗炎作用机制，我们建立大鼠足爪肿胀炎症模型，研究Lut对炎症大鼠 COX2 表达及前列腺素E2（PGE2）生成的影响。 1 材料和方法 1.1 材料 清洁级雄性SD大鼠，体质量150～250 g，由广东医学院实验动物中心提供。角叉菜胶、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等为美国Sigma 公司产品；Lut（纯度gt;98%）和PGE2 EIA Kit为美国Cayman公司产品；βactin山羊IgG多克隆抗体、COX2山羊IgG多克隆抗体、免疫组化SP试剂盒均为北京中山公司产品；PVDF膜为美国Pall Gelman公司产品。 1. 2 方法 　　1.2.1 大鼠分组 　　50只大鼠随机分为5组，分别为空白对照组、2mg/kg地塞米松(Dex)阳性对照组及40、80、120mg/kg Lut 3个剂量组，每组10只。实验时分别腹腔注射等体积生理盐水、地塞米松及40、80、160mg/kg剂量的Lut。 　　1.2.2 大鼠足爪肿胀测定 　　腹腔注射给药30 min后于大鼠右后足跖皮下注射1% 角叉菜胶0.1mL/只致炎，分别在致炎前，致炎后0.5、1、2、3、4、5 h用大鼠足爪容积测定仪测量炎足爪容积， 计算 各组大鼠不同时间点足爪肿胀度。 肿胀度(mL)=致炎后右后足容积－致炎前右后足容积。 　　1.2.3 大鼠足爪炎性渗出物中PGE2含量的测定 　　大鼠右后足致炎5 h后处死大鼠，于大鼠右踝关节处剪下足爪，称重剥皮浸泡于5 mL 生理盐水中浸泡30 min，取出足爪，离心浸泡液15 min(3000×g)，取上清液0.5 mL，以PGE2 EIA Kit测定其中的PGE2含量(μg/g)，并计算抑制率。 　　抑制率IR(%)=对照组PGE2含量-给药组PGE2含量对照组PGE2含量×100% 　　1.2.3 g加入0.2 mL细胞裂解液在匀浆器中匀浆后，将裂解液于冰上超声破碎细胞（10s/次×3次，间隔15s），4℃，12 000g离心10 min, 收集上清液，考马斯亮蓝（G250）染色法测上清液蛋白质含量。每组各取50 μg蛋白质样品加上样缓冲液煮沸变性后，进行10%SDS PAGE；电转移至PVDF膜；用含5%脱脂奶粉的TBS(PH8.0)封闭2 h；分别加入适量COX2和βactin多克隆抗体，摇床上室温反应2 h；洗膜3次每次20 min；加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温反应2 h；洗膜后作ECL化学发光，X片曝光显影。图像经扫描仪扫描后，用图像分析软件BandScan 5.0进行光密度积分值分析，计算目的蛋白与内参照βactin蛋白表达量的光密度积分值之比作为目的蛋白表达量的相对含量值。 　　1.2.4 免疫组织化学（IHC） 　　取足跖部位的组织，用10%中性缓冲福尔马林及时固定，石蜡包埋，切片，贴片，常规脱蜡。0.1mol/L PBS(pH 7.4)浸泡5 min。微波修复抗原。滴加正常山羊血清封闭液(试剂B)，室温20 mi