截短人胱硫醚β-合成酶的可溶性表达、纯化及活性鉴定.pdfVIP

第 41卷第 6期第 697页 华 中科技大学学报 (医学版) VoI．41 No．6 P．697 2012年 12月 ActaMedUnivSciTechnolHuazhong Dec． 2012 截短人胱硫醚 l3一合成酶的可溶性表达、 纯化及活性鉴定* 王利群 ， 顾雅平 ， 曹利民 ， 汪 庆 ， 于海燕。， 奚学志 ， 孙培培 ， 沈关心。△ 常州大学制药与生命科学学院，常州 213164 常州二十一世纪生物技术研究所有限公司，常州 213164 。华 中科技大学 同济医学院基础医学院免疫学系，武汉 430030 摘要 ：目的 构建截短人胱硫醚 8一合成酶(T-hCBS)基 因原核表达载体 ，得到可溶性的T—hCBS蛋 白，为 同型半胱氨 酸检测试剂盒 的开发打下基础。方法 通过优化 T—hCBS基 因，克隆并构建重组表达质粒 pET15b／T—hCBS，转化大肠 埃希菌BI21。使用Ni亲和层析柱对重组蛋 白进行纯化，再通过 HiTrap脱盐柱脱盐 ，采用比色法检测 目的蛋 白活性。 结果 重组蛋 白在大肠埃希菌中可以高效表达 ，产量为 44mg／L，比活约 1100U／mg。15 SDS显示其相对分 子质量为45kD，与预计大小一致。表达菌体超声破碎后上清及纯化的蛋 白溶液均呈现红色。结论 成功克隆和表达 了ThCBS蛋 白，并得到高产高酶活性的可溶性蛋 白，对 同型半胱氨酸检测试剂盒 的开发有一定的潜在应用价值 。 关键词 ：胱硫醚 合成酶 ； 重组 ； 可溶性蛋 白； 表达 中图分类号 ：R345．5 DOI：10．3870／i．issn．1672—0741．2012．06．013 Expression，PurificationandCharacterization ofTruncatedHuman CystathionineI$-synthase W angLiqun ，GuYaping ，CaoLimin ，etal lSchool( PharmaceuticalEngineering Li{eScience，ChangzhouUniversity，Changzhou213164，China 。Changzhou21stCenturyBiotechResearch Institute，Changzhou213164，China Abstract Objeetive Toconstructthetruncatedhumancystathionine8一synthase(T—hCBS)expressvector，andobtainthe solublerecombinantproteinT-hCBS．Methods TheT hCBSgenewasclonedintopET15bvectortoconstructtherecombinant plasmidpET15b／T—hCBSwhichwasthentransformedintoE．coliBL21cellsforexpression．Theexpressedproteinwaspurified bymetal(Ni )chelatingaffinitychromatographyanddesaltedbyHiTrapdesaltingcolumn．Colorimetrywasusedtodetermine theactivityoftherecombinantprotein．Results TherecombinantT—hCBSproteinwasoverexpressedinE．coli，withayieldof 44mg／Landtheactivityofaboutl100U ／mg．Therelativemolecularmasswas45kDbv15 SDS，whichwasconsist— entwiththeexpe