异补骨脂素对小鼠胚胎前成骨细胞TGF-β受体影响实验探究.docVIP

异补骨脂素对小鼠胚胎前成骨细胞TGF-β受体影响实验探究摘 要：目的:探讨经不同浓度异补骨脂素干预对小鼠胚胎前成骨细胞（MC3T3-E1）增殖、Ⅰ型骨胶原的表达、TGF-βⅠ、Ⅱ型受体的影响以及与原发性骨质疏松症的关系。方法：细胞分为正常对照组与不同浓度异补骨脂素组。各组细胞采用MTT方法检测MC3T3-E1细胞增殖情况,天狼星红染色法测定Ⅰ型骨胶原的表达，荧光素酶报告基因检测TGF-β1通路活性以及Western-Blot法检测TGF-βⅠ、Ⅱ型受体的表达。结果：经不同浓度异补骨脂素刺激，可明显促进MC3T3-E1细胞增殖（P 实验细胞： MC3T3-E1、293T细胞购自协和医科大学细胞中心。 1.2 主要试剂与药品 异补骨脂素 中国生物药品检定所。DMEM培养基购自中国医学科学院细胞中心，胎牛血清购自Hyclone公司，硫酸链霉素、青霉素（Hyclone 公司）。MTT购自Sigma公司，DMSO，0.25%胰蛋白酶溶液，天狼星红染液购自Electronic Microscopy Sciences,一抗TGF-βI、TGF-βII（sc-398，sc-400）及二抗购自Santa公司，转染试剂LipofectAMINETM 2000；双荧光素酶报告基因（购自Invitrogen公司）。 2 实验方法 2.1 MTT法检测正常对照组及不同浓度异补骨脂素组MC3T3-E1细胞增殖情况 采用MTT法，以1×10【sup】4【/sup】/孔将细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后，应用无血清培养液培养24h，分别加入经含无水乙醇培养液配制的不同浓度异补骨脂素溶液（10【sup】2【/sup】、10【sup】1【/sup】、10【sup】0【/sup】、10【sup】-1【/sup】、10【sup】-2【/sup】、10【sup】-3【/sup】、10【sup】-4【/sup】、10【sup】-5【/sup】、10【sup】-6【/sup】μM）每组设6个复孔，并设相应正常对照组进行比较，并在培养72时，每组加入MTT至终度为0.5mg/ml；继续培养4h，去除培养液，加入200μlDMSO溶解沉着的色素染料10分钟，上酶标仪检测490nm光吸收值。 2.2 天狼星红染色测定细胞层的胶原含量 去除96孔板中的培养液，－20℃甲醇固定细胞过夜，PBS洗1遍；0.1%天狼星红室温染色1h，去除染液，用0.1%冰醋酸洗3遍，每次5min；每孔加入0.1mol/L氢氧化钠200μL，室温作用1h，振荡混匀，于540nm测光吸收值检测胶原【sup】［4］【/sup】。 2.3 细胞分组 传代细胞分传为5盘细胞（60mm dish细胞培养皿），细胞融合达60%时，吸出每瓶废液；4mL无血清 DMEM，继续置孵箱孵育，同步24h，使细胞静止于Go；每盘为一组，分为五组：正常组、不同浓度异补骨脂素组。正常组，正常培养；不同浓度异补骨脂素组，含有不同浓度异补骨脂素的培养基培养。各组细胞置37℃、5%CO【sub】2【/sub】孵育箱培养，72h后提取总蛋白。 2.4 荧光素酶报告基因 荧光素酶报告基因（12×CAGA）【sup】［5］【/sup】；按照LipofectAMINETM 2000 提供的方法分别转染293T细胞。转染24 h后，同时分别给予不同浓度的异补骨脂素刺激12h后收获细胞，在荧光酶报告分析仪（Top Count）专用的检测板（一种96 孔板）每个孔中依次加入荧光酶催化底物I，Ⅱ以及上述细胞裂解物，并混匀。利用相应软件程序进行荧光酶活性测定，统计分析，绘图。 2.5 Western bloting检测 2.5.1 细胞浆蛋白提取 小鼠胚胎前成骨细胞（MC3T3-E1）在10%小牛血清DMEM培养传代。于实验前采用无血清DMEM同步24 h,然后以终浓度分别为0、10【sup】-1【/sup】、10【sup】-2【/sup】、10【sup】-3【/sup】、10【sup】-4【/sup】μM含药培养基孵育72h,正常对照组不加异补骨脂素。于实验终点分别提取胞浆蛋白,每瓶加入200μL胞浆裂解液冰上裂解30min,用细胞刮刮下细胞移入一预冷EP管中,4℃下离心20000 r/min×5min立即将上清液移入一预冷EP管中与等体积上样缓冲液混匀后100℃煮沸10min，-20℃备用。 2.5.2 步骤 取等体积上述变性蛋白液，于SDS凝胶上进行电泳分离,其中分离胶与浓缩胶浓度分别为10%、4%。然后将胶进行电转膜,取出膜后4℃封闭过夜加入抗人TGF-β1I,Ⅱ型一抗（sc-398，sc-400）,4℃过夜。TBST洗10min×3加二抗