高胆固醇血症患者外周血内皮祖细胞变化及丹参保护作用 .docVIP

高胆固醇血症患者外周血内皮祖细胞变化及丹参保护作用 张怀勤　李海鹰　杨鹏麟　唐疾飞 摘　要：目的：观察丹参对高胆固醇血症患者内皮祖细胞(endotlial progeIlitor cells，EPCs)的保护作用。方法：年龄性别匹配的健康志愿者及高胆固醇血症患者各6例入选研究，各取空腹外周血20mL，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，贴壁选择法行EPcs培养，以健康志愿者为对照组，各高胆固醇血症患者血样一分为二，分别为高胆固醇组及丹参组，丹参组培养时另添加复方丹参注射液10μg/mL，采用流式细胞术、倒置显微镜、MIT法、Boyden小室等分别观察各组EPC8数量、集落形成能力、增殖能力、黏附能力及迁移能力。结果：高胆固醇血症患者外周血EPCs数量较对照组显著下降[(6.13±0.84)vs(24.53±3.67)，P＜0.01]，且其克隆形成能力、增殖能力、黏附能力及迁移能力也显著降低，培养时添加复方丹参注射液使丹参组克隆形成能力、增殖能力、黏附能力及迁移能力较高胆固醇组显著提高，但低于对照组，其中黏附能力及迁移能力虽仍较对照组低。但无统计学差异(P＞0.05)。结论：高胆固醇血症患者外周血内皮祖细胞数量下降，功能受损，复方丹参注射液对高胆固醇血症患者外周血培养的内皮祖细胞功能有保护作用。 关键词：丹参；内皮祖细胞；细胞培养；高胆固醇血症 随着内皮祖细胞(endotllelial progenitor cells，EPCs)的研究逐步深入，EPCs和动脉粥样硬化、冠心病的关系引起研究者极大兴趣。EPCs促进血管新生，参与体内血管内膜损伤的修复过程，在动脉粥样硬化早期预防中起重要作用。高胆固醇血症是动脉粥样硬化、冠心病的重要危险因素。研究发现高胆固醇血症患者外周血EPCs数量减少，功能受损。因此，寻找有效药物动员高胆固醇血症患者体内EPCs、增加外周血EPCs数量并改善其功能成为动脉粥样硬化、冠心病防治的一个研究新方向。丹参具有保护内皮细胞，改善内皮功能的作用。丹参对于与内皮细胞同一谱系的EPCs是否有保护作用呢?本实验观察高胆固醇血症患者外周血内皮祖细胞的变化及丹参的作用，以进一步明确丹参的作用机制。 1　材料 纤维连接蛋白购自Boche公司，VEGF购自PeproTechEC公司，Ⅷ因子相关抗原免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程公司，MTr购自华美生物工程公司PE-CD34购自CALTAG LABORATORIES，FITC-VE-Cadherin购自Bender systemTM公司，PE-VEGFR-2及FITC-ACl33购自RD systems，胎牛血清、胰酶、M199、ECGS、Hank’s液、PBS均购自GIBCO公司，DiI-ac-LDL购自Molecularprobe公司，Boyden小室为江苏海门麒麟医用仪器厂生产，复方丹参注射液为贵州神奇制药生产，其余为市售试剂。 2 方法 2．1 实验分组健康志愿者及高胆固醇血症患者各6例入选研究，高胆固醇血症患者的诊断参照1997年中华心血管病学分会制订的《血脂异常防治建议》，两组年龄、性别匹配。剔除外伤、溃疡、视网膜病、近期外科手术、炎症、肿瘤等影响内皮祖细胞疾病的患者，近3个月无急性心肌梗死、心绞痛发生。各取空腹外周血20mL，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，以健康志愿者为对照组，各高胆固醇血症患者血样一分为二，分别为高胆固醇组及丹参组。 2．2 人外周血EPCs培养，将分离到的单个核细胞，以5×106/cm2密度接种于包被有纤维连接蛋白的24孔培养皿中，每组每份血样各6mm，每皿加入lmL包含有20％胎牛血清、青霉素(100U/mL)及链霉素(100U/mL)的M199，丹参组每皿添加复方丹参注射液101μg/mL，其余各组添加等量培养液，置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。3天后，洗去未贴壁细胞，如前添加培养液继续培养待用。 2．3 EPCs鉴定培养细胞以0.25％胰酶消化后，制成1×106/mL的单个细胞悬液，加入荧光标记的CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2或ACl33 10μL(1mg/mL)，流式细胞仪分析细胞CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2及ACl33的表达。为验证培养细胞吞噬DiI-ac-LDL，将DiI-ac-LDL以2.4μg/mL的终剂量加入培养液，与细胞避光共孵育4h，洗去培养液后荧光显微镜下观察细胞荧光。以不加DiI-ac-LDL的同批培养细胞作空白对照。阴性对照采用GSC7901(胃癌细胞株)。培养细胞Ⅷ因子相关抗原的检测采用免疫组化法，空白对照不加一抗，阴性对照采用GSC7901。 2．4 外周血EPCs数量检测采用本实验室方法，取各