TACO特异性siRNA靶向载体系统的构建和鉴定.pdfVIP

摘要 i TACO特异性SRNA靶向载体系统的构建及鉴定1 摘 要 抑制巨噬细胞(M①)的吞噬体与溶酶体融合是结核分枝杆菌(Mtb)逃避 免疫系统杀伤和在机体内长期潜伏的主要机制。近年的研究发现，Mtb感染后可 诱导MO内的一种富含色氨酸天冬氨酸膜蛋白(Tryptophan．aspartatecontaining coat 噬体与溶酶体的融合。进一步的研究发现，TACO是被吞噬的Mtb在M①内生 存必不可少的条件，阻断TACO的表达可有效促进MQ吞噬体与溶酶体的融合， 从而提高巨噬细胞杀伤和清除Mtb的能力。因此，通过某种有效而特异的手段 抑制M①内TACO的表达可能是一种清除体内Mtb最为直接和有效的办法。本 过特异性RNAi(RNA 用经过基因改造的耻垢分枝杆菌Msl．2c作为载体，使其在M①内定位表达TACO 清除体内的Mtb，为进一步利用siRNA研究基因的功能及治疗结核病奠定了基 础。 第一部分TACO特异性siRNA真核表达质粒的构建 目的：构建针对TACO基因的特异性siRNA的真核表达质粒，为后续的研 究奠定基础。 包括siRNA的正义链和反义链，并且设计了一组对照序列。在互补单链中间连 I和 有loop环，loop环两侧为21bp的以正反向组合的干扰序列，两端为BamH Bbs I酶切位点的粘性末端。针对这些筛选的siRNA序列，合成该序列的 I和Bbs OligoDNA，经退火形成双链DNA，与经BamHI双酶切后的pGPU6／ l 1本课题受江西省自然科学皋金课题(2007GQY460)资助。 II 摘要 肠杆菌后，挑取重组阳性克隆进行酶切鉴定和测序鉴定。 结果：经限制性内切酶酶切和DNA测序结果证实，siRNA核苷酸序列正确 达质粒pSTl、pST2、pST3及对照siRNA表达质粒pST4。 结论：成功构建了针对TACO基因干扰序列的表达载体pST。 第二部分siRNA真核表达质粒在细胞内的表达及其 抑制TACO表达效果的检测 系RAW264．7和293T细胞，在细胞水平检测TACO的表达变化。 此基础上，本部分研究采用了三种不同的方法对taco特异性siRNA表达质粒对 转染小鼠巨噬细胞系RAW264．7，然后以TACO特异性抗体为一抗，红色荧光蛋 白标记的二抗对细胞进行免疫荧光染色，在单细胞水平比较获pST质粒转染(表 达绿色荧光蛋白)和未获转染的细胞的红色荧光的荧光强度，评价siRNA表达 的特点，构建TACO与红色荧光蛋白(PEP)表达基因的融合基因表达质粒： 粒共转染293T细胞，再采用免疫印迹方法检测TACO的表达改变。 结果：转染RAW264．7细胞后荧光定量PCR和westernblot图片表明没有明 光表明细胞内TACO表达明显的降低。在293T细胞中，在蛋白质水平检测到了 TAC0的变化。 111 Irlllllllllll I UlI rllIII ＼1958088 摘要 mRNA及蛋白水平表达下降。 结论：pST干扰质粒可使taco 第三部分重组耻垢分枝杆菌菌苗rMs．pSTM的构建及鉴定 目的：利用经过基因改造的耻垢分枝杆菌Msl．2c作为载体，靶向递送小干 扰RNA的真核表达质粒，观察其靶向性。 方法：将分枝杆菌的复制子ORIM用分子克隆的方法连入siRNA表达质粒 细胞。 后，抗酸染色后