暹罗鳄鱼鳞酶解物改善小鼠免疫力探究.docVIP

暹罗鳄鱼鳞酶解物改善小鼠免疫力探究【摘要】本实验主要研究暹罗鳄鱼鳞酶解物对小鼠免疫力的影响。采用10、20、40mg/kg bw给小鼠经口灌胃 30d，分别进行小鼠抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）、血清溶血素的测定（血凝法）、碳廓清实验。结果发现：鳄鱼鳞酶解物各剂量组的抗体生成细胞数量明显高于阴性对照组，高剂量组与对照组有显著的差异（分别为P＜0.05）；酶解物各剂量组的抗体积数均高于对照组，高剂量有显著差异（P＜0.05）；中、高剂量组均能增强小鼠碳廓清能力，高剂量组与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）。结论：暹罗鳄鱼鳞酶解物能提高小鼠免疫力。 【关键词】暹罗鳄；鱼鳞；酶解物；免疫力 【中国分类号】R267【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0125-01 随着鳄鱼人工养殖的成功，其价值得到多方面的开发，包括旅游观赏、餐饮、时装皮具等等。鳄鱼皮主要用于制作高档皮具，鱼鳞却成了工业垃圾。如何提取、利用鱼鳞的胶原蛋白将会成为水产综合开发的新突破。胶原蛋白的生物活性主要体现在提高免疫活性、降血压、调血脂、抗氧化、活化细胞机能和抑制肿瘤活性等方面［1］。津田友香等从鱼皮中得到水解胶原三肽，并证明具有促进人皮肤成纤维细胞胶原和透明质酸的生成、改善皮肤弹性的作用［2］。Koyama等发现胶原蛋白多肽能提高皮肤真皮和表皮的功能［3］。在美国、德国、日本等国家，许多高档化妆品中添加有胶原蛋白。美国CTFA 化妆品原料手册录用的天然物质和《功能性化妆品原料》中，都有胶原蛋白或其水解产物［4～5］。 文献报道中多为各种鱼鳞胶原蛋白的免疫增强作用，未见鳄鱼鳞胶原蛋白的相关研究。因此，本实验以小鼠为研究对象，探讨暹罗鳄鱼鳞胶原蛋白多肽对正常小鼠免疫功能的影响，为产品开发提供依据。 1 材料和方法［6］ 1.1 材料与试剂:暹罗鳄鱼鳞酶解物：鳄鱼皮购自大丰实业（三亚）有限公司养殖场，酶解物自制。 1.2制法：用热水烫鳄鱼皮，使鱼鳞自皮上脱落，得到鱼鳞，鱼鳞剪成小块，加0.05mol/L－1 NaOH 溶液(W：V＝l：6)浸泡1 h，水洗至中性。再加0.2％硫酸溶液(W：V＝l：6)浸泡1h，洗至中性，最后用热水抽提过夜，4000 r/min－1离心20min，弃去沉淀不溶物，得到粗胶制品，浓缩后，45℃低温蒸干。称取制备的胶原蛋白，用缓冲液(pH9.0，0.02 mol/L －1)100 mI 溶解制成l％的胶原溶液。以酶与底物比为l：20的比例加中性蛋白酶，在45℃水浴中水解5h后，沸水浴中灭活酶15min，4000 r/min－1离心l5 min。取上清液，即为鳄鱼鳞胶原蛋白酶解液，－20℃保存备用。 清洁级 BALB/C 小鼠，雄性，18～22g，购自北京大学实验动物研究中心。脱毛剂、绵羊红细胞（SRBC）、Hanks 液(pH7.2～7.4)、生理盐水、琼脂糖、SA缓冲液、印度墨汁、Na2CO3等。 1.3 仪器与设备:电子天平、微量血凝试验板、离心机、5%CO2培养箱、200目筛网、载玻片、保温箱、721 型分光光度计等。 1.4 动物实验分组与剂量设定:小鼠，18～22g，随机分为4个组，每组12只，分别为鳄鱼鳞酶解物10、20、40mg/kg组和阴性对照组，灌胃30d，阴性对照给予体积为0.2ml/10g生理盐水。 1.5 动物实验检测(1)抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）: 取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心10min（2000r/min），用生理盐水将压积SRBC配成2%（v/v）的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2ml。将免疫后5天的小鼠处死，取脾脏置盛有Hanks液的平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心10min（2000r/min），用Hanks液洗涤2遍，最后将细胞悬液浮在8mL Hanks液中。将表层培养基（1g琼脂糖加双蒸水至100mL）加热溶解后，放45~50℃水浴保温，与等量Ph7.2~7.4、2倍浓度的Hanks液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加入50μL10%SRBC（v/v，用SA缓冲液配制）、25μL脾细胞悬液，迅速混匀后倾倒于已刷琼脂糖层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片平扣在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，用SA缓冲液稀释的补体（1:8）加入玻片架凹槽内，继续孵育1.5h，计数溶血空斑数。用空斑数/全脾细胞表示抗体生成细胞数。(2)血清溶血素的测定（血凝法）：取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心10min（2000r/min），用生理盐水将压积SRBC配成2%（v/v）的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2ml。将免疫5天后，摘除小鼠