BCA法测肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌SR膜蛋白浓度.docVIP

BCA法测肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌SR膜蛋白浓度 　 作者：叶兆伟，李洵，王海燕，李尽哲，承伟 【摘要】 目的测定肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌膜蛋白浓度。方法蔗糖梯度离心法对肺动脉平滑肌膜蛋白进行提取;二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA )法测定膜蛋白浓度;G-6-Pase定量试剂盒测定平滑肌肌浆网(SR)标志酶G-6-Pase活性。结果经测定MCT组和对照组G-6-Pase活性分别为(19.5±2.41)IU/g和(18.35±2.21)IU/g，明显高于肺动脉平滑肌组织匀浆G-6-Pase活性(1.23±0.14)IU/g和(1.15±0.17)IU/g;测定波长为595 nm，在0.025～0.5 mg/ml时，线性关系良好，r=0.997 6。结论提取的SR有较高纯度;BCA法可以用于平滑肌SR膜蛋白浓度的测定。 【关键词】 野百合碱; 肺动脉高压; SR; BCA法 　目前测定蛋白浓度有很多种方法，其中二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowry法相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+。BCA与Cu+结合形成稳定的蓝紫色复合物，在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白浓度成正比，据此可测算蛋白质浓度。与Lowry法相比，BCA法灵敏度高、操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是受杂质的影响较小，故本文选用BCA法对提取的样品进行蛋白浓度测定。 　　1 材料与仪器 　　1.1 动物健康成年Wistar大鼠，雄雌兼用，250～300 g，由辽宁医学院实验动物中心提供。 　　1.2 试剂 野百合碱(MCT)、Tris、马来酸、二硫苏糖醇(DTT)、苯甲基磺酰氟(PMSF)(美国Sigma公司);抑肽酶(aprotinin)、亮肽素(leupeptin)(Amresco Solarbio公司);BCA蛋白测量试剂盒(北京天来生物医药科技有限公司);葡萄糖-6-磷酸酶定量试剂盒(广州天河天一医药保健品公司);其它试剂均为国产分析纯。 　　1.3 仪器ULTRA. Pro 80 型高速低温离心机(美国SORVALL公司); 7170A型全自动生化分析仪(日本日立公司);ELX-800型酶标仪(美国宝特公司)。 　　2 方法 　　2.1 溶液的制备[1] 　　2.1.1 匀浆液30 mmol·L-1 Tris-马来酸(Tris-maleate)，3.0 mol·L-1蔗糖，3 mmol·L-1MgCl2，2 mmol·L-1二硫苏糖醇(DTT)，1 μmol·L-1胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)，1 μmol·L-1亮肽素(leupeptin)，2.4 U抑肽酶(aprotinin)，0.1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)，1 μmol·L-1抗坏血酸钠(Nasocorbate)，pH 7.2。 　　2.1.2 萃取液30 mmol·L-1 Tris-maleate， 0.3 mol·L-1蔗糖， 0.6 mol·L-1 KCl，1 μmol·L-1 leupeptin，0.1 mmol·L-1 PMFS，pH 7.2。 　　2.1.3 储存液30 mmol·L-1Tris-maleate，0.3 mol·L-1蔗糖，1 μmol·L-1leupeptin， 0.1 mmol·L-1 PMSF，pH 7.2。 　　2.1.4 BCA“工作液”按50体积BCA试剂A溶液加1体积BCA试剂B溶液配制，充分混匀备用。 　　2.2 大鼠肺动脉高压的建立[2]健康成年Wistar大鼠腹腔一次性注射MCT生理盐水溶液(60mg·kg-1)，饲养21 d后取出肺和心脏。剪下右心室，左心室、分离室间隔，称重，计算右心室/(左心室+室间隔重量)[RV/(LV+S)]之值。 　　2.3 SR的提取及纯度鉴定 　　2.3.1 SR的提取参照文献[3]采用差速离心法制取肺动脉SR。正常与PAH大鼠各10只，雄雌不限，体质量250～300 g。无菌生理盐水配成20%乌拉坦溶液，按0.5 ml/100 g体重的剂量进行腹腔麻醉，麻醉后快速开胸取出心肺组织，分离肺动脉上的结缔组织，尽可能向肺内部延伸，剪断取出，立即置于-80℃保存。 　　取冻存的MCT组和对照组肺动脉，称重为0.669 5 g和0.252 7 g。按照重量∶体积(V/W)=1∶5加入0℃左右的匀浆液冲洗。然后将肺动脉快速切碎(lt;1mm3)，匀浆，完毕后收集匀浆液于冷冻离心试管中，低