千斤拔黄酮抑制血栓形成机制探究.docVIP

千斤拔黄酮抑制血栓形成机制探究 　 作者：张明秋 关铭 年晓莉 李淑梅 张继梅 【摘要】 目的 探索千斤拔黄酮抑制血栓形成及机制。方法 50只Wistar雄性大鼠随机分为5组，分别为空白对照组(NC)、模型组(MC)、丹参组(SAM)、千斤拔黄酮高剂量组(FPH)和低剂量组(FPL)，每组10只。NC与MC组生理盐水10 ml/kg灌胃;SAM组丹参液10 ml/kg(相当于丹参生药0.1 g/ml)灌胃;FPH组和FPL组按体重10 ml/kg(相当于千斤拔生药1.2 g/ml、0.3 g/ml)灌胃。各组连续灌胃7d，1次/d。末次灌胃后除NC组外，其他各组大鼠制备股动脉血栓模型，并于模型制备后继续灌胃7 d。第7天灌胃1 h后分别对各组大鼠腹主动脉采血，进行血小板聚集率检测，对MC组和FPH组分别用ELISA法进行GMP140、tPA、PAI1含量测定。结果 FPH组与MC组比较，血小板聚集率均明显降低(Plt;0.05，Plt;0.01);GMP140基本保持基础水平，而MC组增高(Plt;0.05);tPA均有不同程度增高，但FPH组增高显著(Plt;0.05)，FPH组血浆PAI1降低，MC组PAI1增高(Plt;0.05)。结论 千斤拔黄酮具有抑制血栓形成作用，其机制主要抑制血小板活化和促进纤溶作用。 【关键词】 千斤拔黄酮;血小板聚集率;GMP140;tPA;PAI1 以往研究表明，中药活血化淤方案在预防和治疗血栓性疾病中起重要作用，其机制是通过抗血小板聚集、抗凝血酶、降解纤维蛋白原、溶解纤维蛋白来实现的。千斤拔黄酮是天然的黄酮类化合物之一，本文通过千斤拔黄酮对血栓模型大鼠的血小板聚集率、血小板α颗粒膜蛋白(GMP140)、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)及I型纤溶酶原激活物抑制因子(PAI1)含量的影响，探讨千斤拔黄酮对血栓形成的抑制作用及机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物 Wistar雄性大鼠50只，体重为180～250 g，均为雄性，由吉林大学实验动物中心提供。随机分为空白对照组(NC)、模型组(MC)、丹参组(SAM)、千斤拔高剂量组(FPH)和低剂量组(FPL)，每组10只。 　　1.2 方法 　　1.2.1 试剂与仪器 千斤拔水提物(提取条件按萃取优化工艺进行);二磷酸腺苷(ADP)，Sigma公司;丹参片(上海雷允上药业有限公司，每片含生药1 g);枸橼酸钠(分析纯，北京化工厂);聚维酮碘溶液(吉林省明星医用消毒药械厂);注射用青霉素钠(160万U，华北制药股份有限公司)。GMP140、tPA及PAI1含量测定(ELISA)全套试剂盒(上海太阳生物技术公司)。LBYNJ2全自动四通道血小板聚集仪LDZ52低速离心机(北京医用离心机厂);WFJ720B型可见分光光度计〔尤尼柯(上海)仪器有限公司〕;光学显微镜(长春第一光学仪器厂)。超低温冰箱MDF382ETECAN Sunrisebasic酶标仪(奥地利)。 　　1.2.2 实验步骤 NC与MC组生理盐水10 ml/kg灌胃;SAM组丹参液10 ml/kg(相当于丹参生药0.1 g/ml)灌胃;FPH和FPL组按体重10 ml/kg(相当于千斤拔生药1.2 g/ml、0.3 g/ml)灌胃。各组连续灌胃7 d，1次/d。末次灌胃后除NC组外，其他各组采用银针钳夹法制备动脉血栓模型。具体方法：将大鼠绑缚在大鼠固定台上，用聚维酮碘消毒并备皮后，利多卡因0.5 ml/只注射于左后肢麻醉，切开左后肢表皮，分离股动脉，用镊子剥离股动脉，将银针刺入股动脉血管，深度为10 mm，并用镊子在刺有银针的血管处从不同角度轻轻钳夹，以造成血管内膜损伤，然后拔出银针，按压止血，缝合切口并注射青霉素预防感染。并于模型制备后继续灌胃7 d。第7天灌胃1 h后分别对各组大鼠腹主动脉采血。实验前将MC组和FPH组大鼠经右颈动脉采血0.9 ml，实验后取腹主动脉血0.9 ml以2% EDTA Na2(血与抗凝剂之比为9∶1)，3 000 r/min离心10 min，收集上层液，-80℃保存待测。 　　1.2.3 检测指标 大鼠腹腔主动脉取血1 ml注入盛有3.8%枸橼酸钠溶液试管中(血与抗凝剂之比为9：1)轻轻摇匀，采用LBYNJ2血小板聚集仪，以1 500 r/min离心5 min，吸取上清液为富血小板血浆(PRP)，放置于8×8方形杯中置恒温孔中备用;余血继续以3 000 r/min离心10 min，吸取上清液为贫血小板血浆(PPP)。取200 μl PPP放入方形杯中用以调零，取200 μl PRP加入盛有搅拌子的方形杯中，PPP调零后，取出PPP方形杯，放入PRP方形杯，待显示血小板读数后，加入终浓度为5×10-4mol/L ADP