在肝癌中BMP-%2c2-对PTEN蛋白水平的影响的研究.pdfVIP

非必需氨基酸NEAA 美国Hyclone公司 MTT 北京夏斯生物技术有限公司 放线菌酮 美国Sigma公司 牛血清白蛋白 北京夏斯生物技术有限公司 无水乙醇 华北制药有限公司 2方法 2．1细胞培养 置培养24小时后换液一次，以后隔天换液一次，待细胞生长至80％融合时，进行传代。[51 (2)吸去细胞培养瓶中的培养液，加入O．25％胰蛋白酶消化液，37℃消化1．2分钟，当细 胞收缩成圆形，细胞间隙清楚，但细胞尚未脱落时，加入完全培养液终止消化，用吸管充 分吹打细胞成单细胞悬液，进行细胞计数，调整细胞密度为5×106／m1个细胞，分装入新培 养瓶中。 2．2BMP2转染细胞模型的制备 储存于4。C冰箱中备用。放线菌酮的配制：将放线菌酮配制成10ug／ml过滤除菌，储存于4。C 冰箱中备用。 培养的细胞中做筛选实验阻断PTEN分子水平的合成，1小时后再加入BMP2。 (3)分别在加入BMP26小时、12小时、24小时后，取出载玻片用PBS洗涤，准备进行 免疫组化检测。 2．3免疫组织和细胞化学方法检测 2．3．1苏木素．伊红(HE)组织学检测 (1)取出长有细胞的盖玻片，用PBS沈3次。 (2)将盖玻片浸入95％酒精固定15分钟。 (3)PBS洗2次，每次1分钟。 (4)苏木素染色5分钟，自来水洗1分钟。 (5)l％盐酸酒精分化20秒，自来水洗1分钟。 (6)PBS返蓝30秒，自来水洗1分钟。 (7)伊红染色3分钟，自来水洗30秒。 (8)80％，85％，90％，95％梯度酒精脱水各2分钟。 (9)无水乙醇5分钟，二甲苯透明，封片剂封片。 2．3_2SABC法 (1)取出盖玻片用PBS冲洗3次，每次5分钟。 (2)将盖玻片放入4％的多聚甲醛(PFA)中浸泡30分钟固定。 (3)取出盖玻片用PBS冲洗3次，每次5分钟。 (4)将盖玻片细胞面朝上放于载玻片上，置于湿盒中。 (5)滴加BSA封闭，常温放置20到40分钟。 (6)甩去多余BSA，每个盖玻片上滴加PTEN一抗lOOul，将湿盒放入4℃过夜。 (7)第二天从冰箱中取出湿盒室温放置1小时。 (8)将盖玻片取下放入洗盒中用PBS洗3次，每次3分钟。 (9)滴加生物素化羊抗小鼠IgG，室温放置2小时以上。 (10)将盖玻片用PBS洗3次，每次3分钟。 (11)滴加SABC，室温放置20分钟。 (12)用PBS冲洗盖玻片4次，每次5分钟。 (13)加DAB显色，光镜下观察呈棕黄色后用蒸馏水终止反应。 (14)封片剂封片。 2．3．3免疫细胞化学结果判定 对免疫组化染色的片子进行图像分析，采用四JI|JI『大智胜软件股份有限公司的 MIAS--2000图像分析系统，测定每个视野的灰度，每张片子测3个视野取平均值。 2．4 MTT法检测细胞生长抑制率 2．4．1MTT溶液的配制： 称取250毫克MTT放入小烧杯中，加50毫升PBS在电磁力搅拌机上搅拌30分钟， 用O．22微米的微孔滤膜过滤除菌，分装，4℃避光保存。 2．4．2具体步骤： (1) 接种细胞：将部分单细胞悬液接种在96孔培养板中，每组接种6孔。待细胞贴 养液。每孔体积200ul。加入之前先用放线菌酮阻断PTEN分子水平的合成。 (2) 培养细胞：将培养板放入C02孵箱，培养6小时、12小时、24小时 (3) 继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150ulDMSO 振荡10分钟，充分溶解。 (4) 比色：选择570rim波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。 (5) 比较各组细胞的生长抑制率 3统计学处理 平方差分析进行各组及组问比较，pO．05表示有统计学意义。 4 结果 1 PTEN蛋白免疫组织和细胞化学检测结果 PTEN蛋白主要定位在细胞质中，呈棕黄色。免疫组化结果显示：在空白对照组中， 表达量越多灰度值越低)，可见细胞中只有少量棕黄色颗粒。在300n∥ml浓度BMP2组中， 组，空白对照组与300ng