某大型长毛兔场兔波氏杆菌病的诊断与防治研究.docVIP

某大型长毛兔场兔波氏杆菌病的诊断与防治研究 王瑞 刘涛 曲哲会 董建国 赵瑜 左春生 易本驰 焦凤超 马超锋 信阳农林学院 信阳市动物疫病预防控制中心 X 关注成功！ 加关注后您将方便地在 我的关注中得到本文献的被引频次变化的通知！ 新浪微博 腾讯微博 人人网 开心网 豆瓣网 网易微博 作者简介：王瑞 (1979-) , 女, 讲师, 研究方向:动物性病原微生物教学与科研。 收稿日期：2017-10-09 基金：基金项目:信阳农林学院科技创新团队 (CXTD-201602) 信阳农林学院预防兽医学教学团队 (JXTD201701) Received： 2017-10-09 兔支气管波氏杆菌病 (Brodetellosis of rabbit) 是由支气管败血波氏杆菌引起的家兔的呼吸道传染病, 本病易发, 给养兔业造成极大的危害和经济损失。2016年11月河南省舞钢市一规模化长毛兔种兔场发生疑似兔波氏杆菌感染, 现将实验室诊断过程报告如下。 1 发病情况 2016年11月10日, 河南省舞钢市一存栏8000余只长毛兔场, 陆续出现病兔, 患病兔从鼻腔中流出黏性分泌物, 打喷嚏, 精神不振, 食欲减退或废绝, 体温升高, 病危时呼吸急促、抽搐, 倒地而死, 随即用抗生素治疗, 但效果不理想, 至16日累计发病90只, 死亡56只。 2 剖检变化 病死兔支气管黏膜充血、出血, 支气管内充满混有泡沫的黏液或稀脓液, 肺脏散在大小不一、数量不等的脓肿, 小的如米粒大小, 大的可达鸽卵大。脓肿个别兔可达到肺体积的90%以上。脓汁黏稠, 呈乳白色乳酪样。 3 材料与方法 3.1 材料 (1) 主要试剂:马丁肉汤、鲍姜氏琼脂培养基、MH培养基、普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、TSA固体琼脂培养基、TSB液体肉汤培养基、细菌微量生化反应管、药敏片购自杭州天和微生物试剂有限公司。 (2) 病料。兔场送检病兔。 3.2 方法 (1) 病料采集与分离。选取有明显临床症状的病兔, 对鼻腔分泌物、肺脏、肝脏进行采集并分别用无菌棉拭子涂布于普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基和5%兔血鲍姜氏琼脂培养基上, 置于37℃恒温箱培养24~48 h, 后选取单个可疑菌落进行纯化培养。 (2) 细菌的生化鉴定。挑取单个可疑细菌, 接种于营养肉汤中, 37℃培养24 h后得到纯培养物, 将纯化后细菌分别接种于细菌微量生化反应管中, 放入恒温培养箱中, 24 h后观察反应结果。 (3) 细菌PCR鉴定。应用Oligo 6.0软件, 根据Gen Bank中波氏杆菌ptx A基因的序列设计引物, PCR扩增核酸片段预期大小425bp, 引物由生工生物工程 (上海) 有限公司合成。上游引物:5-TGAACAATGGCGTGAAAGC-3, 下游引物:5’-TCGATAGTAGGACGGGAGGAT 3。总反应体系25μL:10×Premix Taq 12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板DNA1μL、去离子水9.5μL。PCR反应条件:95℃预变性5 min, 94℃变性45 s, 55℃退火40 s, 72℃复性1 min, 30个循环;72℃延伸5 min, 4℃保存。取扩增产物5μL进行电泳检测。 (4) 细菌耐药性检测。将纯培养的细菌进行扩增, 抽取50μL菌液均匀涂布于MH培养基, 待其晾干约5 min后将药敏片贴于培养基上, 37℃培养24 h后测量抑菌圈大小, 并根据抑菌圈大小判断细菌耐药性情况。所需药敏片:卡那霉素、庆大霉素、青霉素G、复方新诺明、氧氟沙星、林可霉素、红霉素、新霉素、头孢曲松钠、环丙沙星、强力霉素、链霉素、四环素、氨苄西林。 (5) 动物攻毒试验。用灭菌生理盐水洗涤细菌纯培养物, 调整菌数为1.0×10CFU/m L。试验兔隔离饲养饲养3 d, 每只颈部皮下注射0.5 m L菌液, 共攻毒3只。另设同条件对照组2只, 每只肌肉注射0.5 m L灭菌生理盐水, 观察试验结果。 4 结果 4.1 细菌形态及培养特性 采用革兰氏染色法镜检观察结果。可见细菌为革兰氏阴性小杆菌, 两端钝圆, 菌落呈圆形, 光滑, 边缘整齐, 无芽孢。接种于麦康凯琼脂培养基上可见5%兔血改良鲍姜氏琼脂培养基可见周围出现溶血环, 菌落中央凸起, 周围光滑。接种于营养肉汤培养24 h后观察到菌液呈均一浑浊, 细菌生长旺盛。 4.2 细菌生化试验鉴定结果 表1 分离细菌生化鉴定结果 ?? 下载原表 4.3 药敏试验结果 表2 12种抗生素对分离菌株的抑菌圈直径 ?? 下载原表 4.4 细菌PCR鉴定结果 对初步鉴定为兔支气管败血波氏杆菌的细菌进行扩增, 凝胶电泳结果如图1。 图1 PCR反应结果 ??下载原图 4.5 动物攻毒试验结果 对72