离子色谱法测定中国仓鼠卵巢细胞CHO内三羧酸循环有机酸研究.pdfVIP

第10 届全国离子色谱学术报告会论文集（山东威海 2004 ）（ 制作） 1 离子色谱法测定中国仓鼠卵巢细胞（CHO）内三羧酸循环有 机酸 施超欧1 陆苏飙2 栾绍嵘1 张元兴2 (1华东理工大学分析测试中心 200237 上海) (2 华东理工大学生物工程学院 200237 上海) 摘要:建立了离子色谱法同时测定中国仓鼠卵巢细胞内三羧酸循环有机酸的新方法，有机酸包括乳 酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮戊二酸、富马酸、草酰乙酸、柠檬酸、异柠檬酸、顺乌头酸、 反乌头酸及无机酸磷酸。色谱条件：Dionex 600 离子色谱仪,AS11-HC 分析柱，NaOH 梯度淋洗(含 13.5%甲醇)，流速1.3ml/min，化学抑制模式，电导检测。TCA 循环中乳酸、苹果酸、磷酸、柠檬 酸和异柠檬酸可被定量测定。 1.前言 近年来，中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、婴幼仓鼠肾细胞（BHK）及其杂交瘤被广泛用来生 产生物制品，例如疫苗、诊断试剂等。动物细胞培养过程的最优化依赖于我们所掌握的动物 细胞培养的代谢知识。三羧酸循环（TCA）是细胞能量代谢最重要的代谢途径，包括一系列 从丙酮酸到二氧化碳和水的氧化还原反应。在三羧酸循环中，包括柠檬酸、反乌头酸、异柠 檬酸、α－酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、草酰乙酸、乳酸、丙酮酸等有机酸和磷酸 是哺乳动物细胞代谢的重要物质。在哺乳动物细胞培养中，不同培养基条件下获得的不同物 质浓度将提供细胞的生理特征和代谢流向[1]。 虽然有机酸可用酶法分析，但每一种有机酸由独立的酶促反应决定，因此不可能用酶 同时分析多种有机酸[2]。在有机酸分析中色谱方法已经有很多报道[3-5,11,15-17]。如一些酒类[3] [4] 或果汁 的有机酸可用HPLC 在UV 或RI 检测下测定。但这些方法对含碳的有机酸专属性和 灵敏度都不够。有报道用 GC－MS 测定人尿中的有机酸[5]，但酸的衍生化产物不稳定，重复 性差[10] [11] 。离子排斥色谱紫外检测法用于昆虫 hemolymph 有机酸的测定 ，但不能提供一个 完整的包括有机弱酸和无机阴离子的色谱图[12]。另外，相比于果汁、酒类、人尿、发酵液、 植物根系分泌物或动物组织，哺乳动物细胞内的有机酸和无机阴离子的含量是非常低的，用 上述方法都难以测定。 离子色谱（IC）在抑制电导模式下测定有机酸，可以提供比UV 和RI 更高的灵敏度[13,14]。 由于其对不同类型的有机酸和无机酸良好的分离效果可以替代离子排斥色谱。已经成功分离 一些样品的有机酸[6-9,15-17]。然而，关于哺乳动物细胞TCA 循环中有机酸和相关物质的分析， 没有见用离子色谱分析的报道。我们建立了一个新方法同时分离和测定这些痕量有机酸。 2.实验部分 2.1.仪器 离子色谱仪，梯度泵，电导检测器，色谱工作站，ATC-3 捕获柱（24mm×9mm），ASRS-ULTRA 自循环再生抑制器，化学抑制模式。 2.2.试剂 50% NaOH、98％H SO 、甲醇（HPLC 级），超纯水.乳酸、丙酮酸、苹果酸、α-酮戊二 2 4 酸、草酰乙酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、异柠檬酸、顺乌头酸。PO43-标准溶液（0.100g/L）。 2.3.色谱条件 分析柱为 IonPac AS11-HC 阴离子交换柱 (250 ×4mm i.d.) 及其保护柱 第10 届全国离子色谱学术报告会论文集（山东威海 2004 ）（ 制作） 2 AG11-HC(50 ×4mm i.d.)。流速:1.3ml/min。再生液30mmol/L 硫酸，流速7-8ml/min。 进样量为25uL。梯度程序见下表：A:B:C:D=H O:5mmol/LNaOH:100mmol/LNaOH:90%CH OH 2