离子色谱法同时检测发酵液中的琥珀酸等代谢产物研究.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四次全国发酵工程学术讨论会论文集 离子色谱法同时检测发酵液中的琥珀酸等代谢产物 刘宇鹏， 郑璞，孙志浩 (江南大学生物工程学院生物催化研究室元锡214036) 摘要：采用离子排斥液相色谱法对琥珀酸及发酵液中常见的代谢产物进行了分析。以高 交联度磺化苯乙烯一二乙烯基苯共聚物多孔微球作为固定相的AminexHPX-87H离子色谱 柱为分析柱，利用示差折光检测器对八种有机酸(琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、丙酮酸、乳酸、乙 酸、甲酸、丙酸)以及葡萄糖和乙醇进行了成功的分离．通过色谱条件优化，选定了55C柱温 和10mM硫酸作为流动相。发酵液样品中有机酸、葡萄糖和乙醇的平均回收率在96．o％～ 104．8％之间。相对标准偏差在0．4％～3．5％范围内。 琥珀酸(succinic acid)广泛应用于医药，农药，染料，香料，油漆，食品，塑料和照相材 料工业。发酵法生产琥珀酸是一种非常绿色的工业，具有很好的应用前景D]。在发酵的 过程中，准确测定发酵过程中糖的消耗量、有机酸及其它代谢产物的生成量对于研究琥 珀酸产生菌的代谢，指导发酵工艺优化，提高发酵产量具有重要意义。 目前国内外测定有机酸应用较多的是采用C8、C18柱等反相高效液相色谱[2‘33或离 子色谱法“{]，在本文中选用了高交联度磺化苯乙烯一二乙烯基苯共聚物多孔微球作为固 定相的离子色谱法对发酵液中的多种有机酸及糖醇类物质进行了同时分析。该色谱以 离子排斥法为主，同时还集合了离子交换、配位体交换、反相及正相等多种分离机制，这 种多方式的交互作用提供了较好的分离混合物的能力，并且简化了样品的预处理步骤， 分离时间较一般离子色谱也大为缩短，国内还未见有使用离子排斥色谱同时检测发酵液 中琥珀酸及其它代谢产物的报道。 1 材料与方法 1．1仪器与试剂 2414 仪器：美国Waters1512高效液相色谱仪，WatersRI检测器，Waters2487双波 长紫外可见光检测器，Breeze色谱工作站；BioRad公司Aminex HPX一87H离子色谱柱 ram7．8 (300 mm,9pm)． 试剂：甲醇和乙腈均为色谱纯试剂，硫酸为优级纯试剂，实验用水为超纯水。琥珀 酸、柠檬酸、苹果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、葡萄糖、乙醇均为分析纯。 1．2菌种 琥珀酸放线杆菌Actinobacillus 的瘤胃中分离获得‘61。 1．3发酵条件 1．09， 588 第四次全国发酵工程学术讨论会 0．95，NaCI NaH2POI·2H201．0，MgCl20．2，CaCl20．2。用NaOH将初始pH调6． 5。将琥珀酸放线杆菌种子接种于装有50ml发酵培养基的厌氧瓶中，充co,，在37℃下 培养。 1．4样品的处理 取10 ml发酵液，离心除去菌体和沉淀，然后将上清液稀释，再用0．45／．tm的微孔滤 膜过滤备用。 1．5实验方法 1．5．1标准溶液的配制 准确称取一定量的各有机酸、葡萄糖和乙醇的标准品，用超纯水配成混合标准溶液， 一共10种物质。其中，琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、甲酸、丙酸这8种有 机酸和乙醇的浓度为0．5g／L，葡萄糖浓度为1．0g／L。 1．5．2色谱条件 mm×7．8 色谱分离柱：BioRad公司AminexHPX一87H色谱柱(300mm，9／．tin)；RI 检测器；UV检测器；流动相：4,--,12mM硫酸；柱温40～60℃；流速0．5ml／min；进样量 10弘L。 2结果与讨论 2．1有机酸及糖醇物质分离条件的研究 2．1．1检