酶的制备与纯化.pptVIP

三、酶的分离纯化 建立一个可靠快速的测活方法 酶原料的选择 酶的提取 酶的提纯 酶纯度的鉴定 建立一个可靠和快速的测活方法 可靠性表现在专一、灵敏、精确、简便 测活方法是否经济 测活方法越简单，纯化所需等待时间越短，失活越少 一个好的测活方法的建立，就是整个纯化工作成功的一半。 酶提取方法的选择 生物材料的破碎 机械（匀浆）法 适合动物、植物、微生物 超声波法 破碎细胞和细胞器的有效手段， 细菌 酵母 冻融法 细胞胞液结成冰晶，使细胞壁涨破，效率不高 渗透压法 最温和的方法，如红血球破壁，不适于细菌及植物 酶消化法 利用酶解作用，使细胞壁崩解破碎 可加入蛋白酶抑制剂如PMSF（苯甲基磺酰氯）、 EDTA、还原剂DTT（二硫苏糖醇）等，保护目的酶。 酶提取方法的选择 抽提液由以下几部分组成 离子强度调节剂 KCl NaCl 蔗糖 pH缓冲剂 各种 Buffer 温度效应剂 甘油 二甲基亚枫(DMSO) 蛋白酶抑制剂 PMSF DIFP 抗氧化剂 DTT 巯基乙醇 重金属络合剂 EDTA 柠檬酸 增溶剂 TritonX-100 酶纯化方法的选择 调节酶溶解度的方法 根据酶分子大小、形状不同的分离方法 根据酶分子电荷性质的分离方法 根据酶分子专一性结合的分离方法 酶纯化方法选择的一般原则 调节酶溶解度的方法 改变离子强度 硫酸铵分级盐析 反抽提法 RNA聚合酶的硫酸铵分级沉淀 42－55％ 收集33－50%饱和度的沉淀。 将沉淀再悬浮于42％饱和度中，去除某些杂蛋白。 改变pH值或温度 调节pH至pI， 加热去除杂蛋白 改变介电常数 常用有机溶剂乙醇、丙酮、甲醇 根据酶分子大小、形状不同的分离方法 离心分离 凝胶过滤 透析 超滤 Ultrafiltration Ultrafitration has become a widely used technique in preparative biochemistry. Ultrafiltration membranes are available with different cutoff limits for separation of molecules from 1 kD to 300 kD. The method is excellent for the separation of salts and other small molecules from a protein fraction with a higher molecular weight and at the same time can effect a concentration of the proteins. The process is gentle, fast, and comparatively iexpensive. 根据酶分子电荷性质的分离方法 离子交换柱层析 Ion exchange chromatography 层析聚焦法 电泳 Electrophoresis in Gels 等电聚焦电泳 Isoelectric Focusing 免疫电泳 Immunoelectrophoresis Isoelectric Focusing (IEF) IEF can be described as electrophoresis in a pH gradient set up between a cathode and an anode with the cathode at higher pH than the anode. Proteins, being amphoteric species, are positively charged at pH values below their pI and negatively charged above their pI. It means that whenever a protein is in the gradient, it will migrate towards its pI. 根据酶分子专一性结合的分离方法 亲和层析 Affinity chromatography 免疫吸附层析 染料配体亲和层析 共价层析 Covalent chromatography 酶纯度的评价 超速离心 电泳 SDS－电泳 等电聚焦 N－末端分析 免疫技术 注意事项 严格控制实验条