猪圆环病毒PCR检测方法的建立.docVIP

猪圆环病毒PCR检测方法的建立 澎江廖种学2009年第4期 猪圆环病毒PCR检测方法的建立 王东方.,魏战勇.,崔保安,陈红英,郭小参,吕晓丽,管倩 (1.河南农业关学牧医工程学院,河南郑州450002;2.河南省动物性食品安全重点实验室,河南郑州450002 3.河南省动物疫病预防控制中心,河南郑州450o08) 摘要:本研究建立了检测猪圆环病毒的PCR方法,并对该方法进行了标准化研究.该方法具有快速,敏 感,特异性强等特点,从PCV2感染的细胞中可最低扩增到0.1ng的DNA,且对其它病原微生物如PRV,PPV不 能检出.可对病料,血清提取DNA进行检测,所有程序在5h内得出结果.该方法可用于PCV2感染猪的快速诊 断,引种检疫,分子流行病学调查. 关键词:PCR;检测;猪圆环病毒 中图分类号:$859.81文献标识码:B文章编号:0528—9017(2009)04.0812.04 猪圆环病毒(porcinecireovirus,PCV)是迄今为 止发现的最小的一种脊椎动物病毒.根据PCV的 致病性,抗原性及核苷酸序列将PCV分为PCV1和 PCV2两个基因型.PCV1广乏存在于猪体内及 猪源代细胞系中,无致病性,不能引起细胞病变; PCV2具有致病性,主要引起一种新发现的传染 病——断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemicwastingsyderome,PMWS).PMWS主要 以进行性消瘦和多系统病理损伤为特征,已给全球 养猪业造成相当严重的经济损失.据报道,1991 年PMWS首发于加拿大;目前世界其它地方普遍 有PMWS发生的报道.在我国,郎洪武等首次报 道我国猪群存在PCV2感染以来,已陆续有二十几 个省,自治区,直辖市报道有猪圆环病毒的感 染一. 对于该病诊断已有病毒分离,免疫荧光法, ELISA方法,免疫组化法等方法.这些方法操作烦 琐,困难,经常受到条件制约,原位杂交等. 目前广泛应用的PCR具有较高的敏感性和特异性. 然而由于不同的引物之间差别较大,以及PCR扩 增时各种因素的影响,使得PCR方法的特异性和 敏感性各不相同,因此用于诊断时往往容易出现假 阴性的结果.我们针对最常见的3种扩增PCV2的 引物区域设计,比较了对引物的特异性和敏感性, 优化了PCV2的PCR,诊断方法,建立了检测与诊 断猪圆环病毒的PCR方法.这将有助于我国猪群 PCV2疫情的监测,也能为控制该病的传播提供技 术支持. 1材料和方法 1.1试验材料 PCV2为中国农大杨汉春教授惠赠,猪细小病 毒(PPV),伪狂犬(PRV)均为本室保存之毒种. PK15细胞(无PCV1污染)为本室保存.DMEM购 自华美生物工程公司;葡萄糖胺购自Sigma公司; 无菌胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司. pGEM—Teasy载体购自Promega公司,TaqDNA聚合 酶,dNTPs,Mg2,MarkerDL2000购自TaKaRa公 司,异硫氰酸胍(GuSCN),饱和平衡酚,酚:氯仿 :异戊醇(25:24:1),氯仿:异戊醇(24:1)等均购 自上海Sangon有限公司. 1.2引物设计 根据GenBank已发表的PCV2全基因序列 AF027217,选择ORF1和ORF2设计3对引物pl/ P2,P3/P4和P5/P6(表1).引物由上海生物工程 公司合成. 1.3病毒培养 猪圆环病毒株及病毒接种无PCV1污染的50% 长满的PK15细胞系单层细胞(用DMEM培养基培 养,含10%小牛血清,100U青霉素,100g?mL 收稿日期:2009.03.21 基金项目:河南省杰出人才创新基金项目(0621002100) 作者简介:王东方(1980一),男,河南新郑人,硕士,从事动物技术研究工作. 注:崔保安系通讯作者,E—mail:baoancui@henau.edu.cn. 王东方,等:猪圆环病毒PcR检测方法的建立田 链霉素),37oC培养18h,当细胞增至80%时弃去 培养液,用Hanks碱性盐溶液配制的300mmol?L 葡萄糖胺37℃作用30min.换新鲜培养液,至细 胞长满.细胞未出现任何特异性病变,仍保持良好 状态,培养72h,用0.25%胰蛋白酶.EDTA消化, 盲传3代后,取培养液一20℃室温冻融3次. 一 70℃保存. 1.4PCV模板DN的制备 参照分子克隆实验指南所述DNA提取方法 进行. 1.5猪圆环病毒PCR扩增 PCV2PCR反应采用50反应体系,其组份 如下:10×PCR缓冲液5tLL,MgC12浓度为4 mmol?L～,NTPs浓度为200tLmol?L～,Taq酶1U, 引物P1,P2浓度为0.5p.mol?L～,模板5,最 后用双蒸馏水补至50p.L.PCR扩增条件为:9