实验二_遗传病基因突变分析.pptVIP

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2018-04-16 发布于广东
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实验二_遗传病基因突变分析.ppt

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用于SSCP的药品和试剂：显影液 Na2CO3 2.96 g 双蒸水加至100ml, 临用时配, 夏天4℃冷藏甲醛临用时加 54 ?l 10%硫代硫酸钠临用时加 10 ?l 10%乙酸 10%乙醇 1%HNO3 AgNO3 载样缓冲液（loading buffer）　　　　　　 95%甲酰胺 20 mM EDTA 溴酚蓝少许　　二甲苯氰少许 * * 医学遗传学实验俞萍 pingyu@zju.edu.cn 科A713 遗传病基因突变分析（SSCP）实验内容 7.5?l PCR产物冰水浴中骤冷10分钟混匀后，100?C沸水中加热变性10分钟加样电泳(140V,~2hr) 银染,约50分钟 7.5 ?l loading buffer （95%甲酰胺） 1.5ml离心管遗传病基因突变分析实验原理 1）DNA抽提 2）聚合酶链反应 3）单链构象多态性分析 1）DNA抽提核基因组DNA可以从任何有核细胞中提出 Agarose gel electrophoresis 双蒸水 10*Buffer MgCl2 dNTPs（ATP/CTP/GTP/TTP） Primer（引物）R + F DNA 模板 Taq-DNA聚合酶石蜡油 PCR 2）聚合酶链反应聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外由引物介导的特定DNA序列的扩增方法. 变性：95℃,1min 退火：温度和引物有关延伸：时间和待扩增产物长度有关 72 ℃ for Taq Step 1 (1个循环) 94?C 5分钟 Step 2 (30个循环) 94?C 30秒 59?C 30秒 72?C 30秒 Step 3 (1个循环) 72?C 5分钟 3）单链构象多态性分析单链构象多态性 Trp(色氨酸)→Arg(精氨酸) 双甲基丙烯酰胺（ methylene-bisacylamide, Bis) 单体丙烯酰胺（acrylamide, Acr） TEMED：四甲基乙二胺，加速丙烯酰胺凝胶的聚合 10%APS：（过硫酸胺）催化剂 H2O 丙烯酰胺凝胶电泳凝胶组分