dorglt1gsnmda受体通路在瑞芬太尼痛觉过敏中的作用及氢气治疗作用研究word格式论文.docx

学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：2015 年 05 月 10 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密?。（请在相对应的方框内打“√” ）学位论文作者签名：日期：2015 年 05 月 25 日 导师签名 ：日期：2015 年 05 月 26 日中文摘要DOR-GLT-1/GS-NMDA 受体通路在瑞芬太尼痛觉过敏中的作用及 氢气治疗作用研究目的 探讨 DOR-GLT-1/GS-NMDA 受体通路在瑞芬太尼引发痛觉过敏中的作用 以及饱和氢盐水缓解瑞芬太尼诱发的痛觉过敏的具体机制探究。内容 制作大鼠切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏模型，从在体水平证明 DOR-GLT-1/GS- NMDA 受体通路相关蛋白或受体表达水平或功能的改变在阿片类药物引发的痛 觉过敏过程中发挥的重要作用。建立大鼠体外脊髓片孵育模型，从离体水平证 明 DOR 在瑞芬太尼诱发的 NMDA 受体电流变化中发挥重要调控作用。从在体 水平证明 HS 是通过修复 GLT-1、GS 及 NMDA 受体功能进而缓解痛觉过敏的发 生，为临床痛觉过敏的预防和治疗提供新的思路。方法 该研究主要分为三部分：第一部分：尾静脉置管成功的雄性 SD 大鼠 40 只， 随机数字法分为 5 组，每组 8 只：对照组（C 组）：尾静脉持续输注生理盐水（NS）； 切口痛组（I 组）：经尾静脉持续输注 NS，同时按照 Brennan 法建立切口痛模型； 甘氨酸组（G 组）：经尾静脉持续输注甘氨酸 15 μg·kg-1·min-1，同时建立切口痛 模型; 瑞芬太尼组（R 组）：经尾静脉持续输注瑞芬太尼，不建立切口痛模型； 瑞芬太尼+切口痛组（RI 组）：经尾静脉持续输注瑞芬太尼，同时建立后足手术 切口 ； 生 理 盐 水 或 瑞 芬 太 尼 的 输 注 剂量 分别 为 0.1ml·kg-1·min-1 或 1.0μg·kg-1·min-1，输注时间恒定，均为 1 小时。于输注前 1 天（基线值）、术后2h、6h 、24h、48h 测定机械性缩爪阈值（PWT）和热刺激缩爪潜伏期（PWL）， 在行为学测定结束后取 L4-6 脊髓节段，采用免疫沉淀及免疫印迹法测定大鼠脊 髓背角 DOR 膜蛋白及总蛋白，MnSOD、GLT-1、GS 总蛋白及硝基化蛋白及 NMDA 受体 NR1，NR2A，NR2B 亚基硝基化蛋白，膜蛋白和总蛋白的表达水平变化。 第二部分：在体实验：鞘内置管及尾静脉置管成功的雄性 SD 大鼠 32 只，随机 分为 4 组（n = 8）：DOR 激动剂 deltorphin II 或抑制剂 naltrindole+RI 组（D+RI 组或 N+RI 组）：在经尾静脉置管输注瑞芬太尼 1.0 μg·kg-1·min-1 前，鞘内给予 4nM deltorphin II(10μl) 或 30nM naltrindole (10μl)，再行切口痛模型；C 组及 RI 组同上。采用免疫沉淀及 Western Blot 法测定大鼠脊髓 MnSOD，GLT-1,GS 及INMDA 受体 NR1，NR2A，NR2B 亚基硝基化蛋白，膜蛋白和总蛋白的表达情况。离体实验：取出生 14-18 天的雄性 SD 乳鼠 40 只，随机分为 5 组（n=8）：C 组， 取腰段脊髓（L4-6），制备脊髓片，置入人工脑脊液（ACSF）中孵育；G 组：脊 髓片置入含甘氨酸的 ACSF 中；R 组，脊髓片置入含瑞芬太尼的 ACSF 中；RD 组，脊髓片置入含瑞芬和 DeltorphinⅡ的 ACSF 中；RN 组，置入含瑞芬和 naltrindole 的 ACSF 中，甘氨酸、瑞芬、DeltorphinⅡ及 naltrindole 终浓度分别为 0.24 μmol/L、4nmol/L、10nmol/L 和 1nmol/L。孵育 1 小时后，显微镜下找到脊 髓背角神经元，运用全细胞膜片钳技术记录此处 NMDA 受体介导的微小兴奋性 突触后膜电流（mEPSC）。第三部分： 48 只雄性 SD 大鼠，随机数字表法分为 6 组，每组八只：饱和氢盐水（HS 组）：以 10ml/kg 剂量经