egcg通过上调nrf2ho1途径降低pm2.5所致huvec氧化损伤的机制研究word格式论文.docx

1材料和方法391.1 细胞株391.2 主要试剂和仪器391.3 试验方法421.4 统计分析482结果492.1 Nrf2 RNA干扰质粒Nrf2-shRNA构建成功492.2 PM2.5 作用于Nrf2-shRNA干扰的HUVEC细胞后细胞存活率的效应502.3 PM2.5 作用于Nrf2-shRNA干扰的HUVEC 细胞后ROS的效应512.4 PM2.5 作用于Nrf2-shRNA干扰的HUVEC 细胞后Nrf2/HO-1 表达的效应.533讨论544结论55参考文献56综述61致谢95在学期间承担/参与的科研课题与研究成果96个人简历97EGCG通过上调Nrf2/HO-1通路降低PM2.5介导的HUVEC氧化损伤的机制研究摘要随着社会发展和工业化进程的不断推进，大气污染日益严重，并且已经成为威胁人类健康的主要因素之一，越来越受到社会各界的广泛关注。大气污染中可吸入细颗粒物(PM2.5，即空气动力学直径≤2.5μm细小颗粒物)由于表面积巨大，易吸附大量浓缩的有毒物质，对人类健康极具威胁。大量流行病学研究发现，长期暴露于环境中的PM2.5或者PM2.5浓度急剧升高时心血管疾病的发病率和病死率都会升高，可以推断PM2.5 与心血管疾病的发生发展密切相关。由内皮细胞组成的血管内皮系统是血管中的血液及其成分与外界之间的重要屏障，对外来刺激以及毒性物质的侵袭具有重要的防御功能。有研究发现，血管内皮暴露于PM2.5后会引起氧化应激，进一步刺激产生过多的活性氧物质，后者损伤内皮细胞致使内皮功能障碍，外源毒物入侵，导致各种疾病的发生。并且报道称在PM2.5 引起内皮细胞氧化应激的早期机体会通过自身保护机制，激活转录因子核因子E2 相关因子2 (Nrf2)/血红素加氧酶-1 (HO-1)抗氧化途径以中和活性氧物质。可见内皮细胞的重要性非同一般，因此，本课题选取人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为研究对象，观察PM2.5 对HUVEC细胞的毒性作用。绿茶是人们日常生活中最流行饮品之一，绿茶中茶多酚的主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是一种强效的抗氧化剂，通过清除自由基而发挥抗氧化、抗衰老、抗癌等保护作用。相关研究发现，EGCG是通过激活Nrf2/HO-1通路而发挥抗氧化功能的。因此，本研究的目的是观察EGCG是否能通过激活Nrf2/HO-1通路抑制PM2.5 所介导的HUVEC氧化应激损伤，并进一步研究其分子机制和信号通路。结果显示：200μg/ml 的PM2.5显著增加细胞死亡率和细胞内ROS 水平，而50~400μM 的EGCG 以浓度依赖性的方式降低细胞内ROS水平，抑制细胞死亡率；为探明其分子机制，我们采用Western blot 和Real-time PCR 等分子生物学技术，发现PM2.5 可以使HUVEC 细胞中Nrf2和HO-1 的表达减少，而EGCG可以逆转此作用；同时，我们选用MAPK 通路阻断剂，观察EGCG保护作用的信号通路。其中，PD98059(胞外信号调节激酶[ERK1/2]的选择性抑制剂)和SB203580(p38MAPK 蛋白的选择性抑制剂)，不仅可以抑制EGCG 诱导的Nrf2和HO-1 的表达增加，而且可以使EGCG降低活性氧和提高细胞生存率的作用消失，但SP600125 (c-jun 氨基末端激酶[JNK]的选择性抑制剂)无此效应。此外，为了明确Nrf2在EGCG 发挥抗氧化保护作用中的关键作用，我们采用基因沉默技术，人为降低Nrf2的表达后EGCG上调细胞内HO-1 蛋白表达、降低活性氧以及提高细胞生存率的效应消失。综上所述，当HUVEC细胞暴露于PM2.5时，EGCG可能通过活化p38MAPK 和ERK1/2 信号途径，上调Nrf2介导的HO-1表达，降低活性氧的产生，提高细胞存活率，从而防止心血管疾病的发生发展。第一部分EGCG在PM2.5所致HUVEC细胞损伤中的作用目的：本部分研究通过大气细颗粒物PM2.5水溶成分对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行干预，观察EGCG 对PM2.5 所致的HUVEC损伤的影响。方法：1. 细胞株人脐静脉内皮细胞细胞株：购自中国科学院上海细胞库。2. 试验方法2.1 PM2.5 水溶成分的提取2.2HUVEC细胞培养选用高糖型DMEM 培养基+10%胎牛血清+1%青链霉素混合液为细胞培养基，于37℃，含5%CO2和95%空气的培养箱中进行培养，待细胞融合度达80%以上即可进行传代。2.3检测指标2.3.1检测HUVEC 细胞存活率(细胞计数Kit-8 法)2.3.2检测HUVEC 细胞内活性氧水平(DCFH2-DA探针标记流式细胞术分析和激光共聚焦显微镜)结果：1. EGCG对HUVEC 细胞存活率的影响取50~200μM的EGCG作用于HU