fat1表达载体构建及转fat1基因萨福克羊成纤维细胞系的建立分析word格式论文.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 PAGE PAGE 5 中文摘要 目的：ω-3PUFAs 对于维持生命有机体的正常发育和生长，防治各种疾病都有至关重要 的作用，由于缺乏能够将ω-6PUFAs 转化成ω-3PUFAs 的脱氢酶基因，人体内的ω-6/ ω-3PUFAs 达不到 1:1 理想的平衡，所以每天必须摄入一定量的ω-3PUFAs，来保证有 机体正常的功能和自身稳定。目前富含ω-3PUFAs 食物主要是深海鱼类，来源范围很窄， 导致人体内ω-6PUFAs 过多而ω-3PUFAs 严重不足，对婴幼儿智力发育、心脑血管疾病 和癌症的预防起不了积极作用。因此从家畜繁殖与育种的角度出发，制备能够表达 ω -3PUFAs 的脱氢酶基因 Fat-1 的新品种绵羊，从而培育出富含ω-3PUFAs 高品质羊肉。 方法：1. Fat-1 表达载体构建及转基因细胞系建立 采用组织块附植法分离得到了 18 月龄萨福克公羊成纤维细胞系；通过 PCR 扩增得 到了人泛素启动子 UbB 序列，对秀丽隐杆线虫 Fat-1 基因密码子根据绵羊对同义密码子 使用偏好性进行优化，然后由公司合成获得 oFat-1 基因序列；双酶切法从 pcDNA3.1 中 获得 GBHpolyA 序列，将上述 3 段序列共同插入 pCMV-DsRed2-1 载体的多克隆位点 （MCS），得到重组真核表达载体 pUbB-oFat-polyA-CMV-DsRed，载体序列再经酶切和 测序，结果与预期一致。用单酶切法将表达载体线性化后，采用脂质体包裹后转染绵羊 成纤维细胞，经 G418 抗性和红色荧光标记筛选得到阳性细胞，并进行 PCR 和反转录 PCR 鉴定，HPLC 检测细胞中不饱和脂肪酸的变化。 2. 转基因绵羊的制备 将得到的转 Fat-1 的绵羊成纤维细胞作为核移植供体细胞，移入去核后的绵羊成熟卵 母细胞内制备克隆胚，经过融合、激活、发育得到的 2 细胞期重构胚，移入同步处理的 31 只受体羊子宫内，6-7 枚/羊，妊娠并产下羔羊后 PCR 初步检测外源基因，分别取三 只羊耳部皮肤体外培养，进行细胞染色体数目分析。 结果：构建的真核表达载体序列正确，Fat-1 基因能够在绵羊成纤维细胞基因组中正常 表达，促进细胞ω-6PUFAs 向ω-3PUFAs 转化，ω-3PUFAs 占总量的百分比从 11.48%增 加到 24.41%,ω-6PUFAs 的百分比从 88.52%下降到 75.59%，ω-6PUFAs/ω-3PUFAs 比值 从 7.82±0.18 下降到 3.10±0.03，差异极显著（P＜0.01）。经过胚胎移植后有 3 只母羊 妊娠，妊娠率 9.67%，并顺利产下 3 只羔羊。经 PCR 初步检测有两只为转基因阳性，分 别取三只羊耳部皮肤体外培养，进行细胞染色体数目分析，显示均具有正常的二倍体核 型。 结论：成功构建了 UbB 启动子介导的 Fat-1 真核表达载体,筛选得到表达不饱和脂肪酸 脱氢酶的绵羊细胞，实现人泛素启动子 UbB 调控外源基因 Fat-1 在绵羊细胞内表达，并 经过核移植技术克隆得到了 2 只转基因羊，为进一步制备转基因克隆绵羊奠定了基础。 关键词：人泛素启动子 UbB；Fat-1；表达载体；绵羊成纤维细胞；PUFAs；染色体 PAGE PAGE VI Abstract Objective ： ω-3PUFAs palys an important role in maintain normal development, growth and disease prevention of living organisms. Invivo ω-6/ω-3PUFAs level cannot be balanced to 1:1 as human being is lack of the dehydrogenase gene in transforming ω-6PUFAs to ω-3PUFAs. Therefore, to ensure that the normal organism function and its stability, a certain amount of ω-3PUFAs must be consumed every day. At present, deep-sea fishes are the main resources of ω-3PUFAs in daily food. As ω-3PUFAs source is very narrow, human body’s ω-6PUFAs level are too high and ω-3PUFAslevel are