h感受器在星型胶质细胞和血管内皮细胞表达及功能-expression and function of h receptor in astrocytes and vascular endothelial cells.docx

vscontrol),167.99±8.66%(n=3,p0.01vscontrol),190.41±17.58%(n=3,p0.01vscontrol),203.41±6.80%(n=3,p0.01vscontrol)；各时间点Ser635磷酸化水平较对照组分别升高151.62±20.93%(n=3,p=0.07vscontrol),233.33±27.68%(n=3,p0.01vscontrol),253.99±45.81%(n=3,p0.05vscontrol),277.78±46.57%(n=3,p0.05vscontrol);各时间点Thr497磷酸化水平较对照组分别升高144.88±8.98%(n=3,p0.01vscontrol),207.95±36.89%(n=3,p0.05vscontrol),251.03±49.21%(n=3,p0.05vscontrol),313.12±40.51%(n=3,p0.01vscontrol)。2.NH4Cl诱导的急性代谢性酸中毒对小鼠胸主动脉eNOS磷酸化位点Ser1179、Ser635和Thr497磷酸化水平的影响用NH4Cl(2.5M)给小鼠灌胃3小时后，对照组小鼠血清pH值为7.48±0.02，NH4Cl处理组小鼠血清pH值降为7.11±0.05(n=6,p0.01vscontrol)。NH4Cl处理组小鼠胸主动脉eNOS各磷酸化位点磷酸化水平显著升高，其中Ser1179较未处理组升高160.54±18.86%(n=6,p0.05vssham)，Ser635较未处理组升高216.97±43.53%(n=6,p0.05vsshamgroup)，Thr497较未处理组升高222.94±39.08%(n=6,p0.05vsshamgroup)，总的eNOS表达水平与对照组相比未见明显差异。3.细胞外H+对血管内皮细胞亚硝酸盐生成及血管形成的影响分别用pH值为7.4和7.0的细胞外液孵育内皮细胞1小时，然后再用1μMA23187孵育1小时，孵育液亚硝酸盐浓度由0.17±0.06增加到0.67±0.08(n=6,p0.01vspH7.4)。用pH值为7.4和7.0的细胞外液孵育贴胶的HUVECs2小时，然后换成含25%FBS和ECGS培养基继续培养15小时，通过显微镜观察血管形成。未用任何细胞外液孵育组血管形成累积长度为8322.5±529.60μm(n=4),pH值7.4细胞外液孵育组血管形成累积长度为7815±499.50μm(n=5)，pH值7.0细胞外液孵育组血管形成累积长度较pH值7.4组显著增加，为30659±3985.56μm(n=5,p0.01vspH7.4)。在pH7.0孵育2小时结束后加入NOS抑制剂L-NAME(500μM)，血管形成累积长度较pH7.0外液孵育组显著减少，为13840.5±510.73μm(n=5,p0.01vspH7.0)。结论：1.细胞外H+增加原代培养BAECs细胞eNOS磷酸化位点Ser1179、Ser635和Thr497的磷酸化水平，呈剂量和时间依赖关系。2.NH4Cl诱导的急性代谢性酸中毒使小鼠血浆pH值显著下降，血管内皮细胞eNOS各磷酸化位点磷酸化水平显著升高。3.细胞外H+增加血管内皮细胞NO生成量，后者促进由eNOS介导的HUVECs血管形成。关键词：H+；eNOS；NH4Cl；NO；磷酸化；血管形成第三部分H+感受器在酸介导的eNOS激活过程中的作用及机制目的：细胞膜H+感受器主要包括ASICs、TRPV1和H+敏感的G蛋白耦联受体。其中，前两者属于配体门控阳离子通道，主要介导Na+和Ca2+内流。Na+参与Na+/H+和Na+/Ca2+交换，Ca2+通过CaMKII等激酶参与信号级联反应；后者是G蛋白耦联受体超家族中的一员，通过小G蛋白参与信号级联反应。细胞外酸化对eNOS的磷酸化调节是否由上述H+感受器介导，如果是，又是由哪种H+感受器介导的，H+感受器被激活后与eNOS之间的信号级联反应如何，是我们进一步研究的重点。方法：WesternBlotting结果：1.细胞外来源的钙离子和细胞内来源的钙离子在细胞外酸化引起的eNOS磷酸化中的作用(1)细胞外来源的钙离子对细胞外酸化引起的eNOS磷酸化的影响。去除外钙，由细胞外酸化引起的eNOS-Ser1179和Thr497磷酸化水平升高受抑。用含EGTA(5mM)的细胞外液(pH7.0)孵育内皮细胞，与对照组相比，eNOS-Ser1179和Thr497磷酸化水平的升高几乎被完全抑制，而Ser635的磷酸化水平不受影响。(2)细胞内来源的钙离子对细胞外酸化引起的eNOS磷酸化的影响用50μMBAPTA-AM预处理细胞30分钟，与DMSO处理组相比，BAPTA-AM几乎完