结核分枝杆菌htpg蛋白表达纯化、结晶及其与crrna相互作用-expression, purification and crystallization of mycobacterium tuberculosis htpg protein and its interaction with cr rna.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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结核分枝杆菌htpg蛋白表达纯化、结晶及其与crrna相互作用-expression, purification and crystallization of mycobacterium tuberculosis htpg protein and its interaction with cr rna.docx

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结核分枝杆菌htpg蛋白表达纯化、结晶及其与crrna相互作用-expression, purification and crystallization of mycobacterium tuberculosis htpg protein and its interaction with cr rna

独创性声明本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位（毕业）论文作者亲笔签名：日期：论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。□不保密，本论文属于不保密。□学位（毕业）论文作者亲笔签名：日期：指导教师亲笔签名：日期：目录摘要I英文缩写表V1文献综述11.1结核病11.1.1世界结核病疫情11.1.2我国结核病疫情11.1.3结核病简介11.1.4结核病分类21.1.5结核病历史21.2结核分枝杆菌21.2.1结核分枝杆菌的形态31.2.2结核分枝杆菌细胞壁成分31.2.3结核分枝杆菌的抗酸染色31.2.4结核分枝杆菌的生长特性31.2.5结核分枝杆菌的生化特点41.2.6结核分枝杆菌的抵抗力41.2.7结核分枝杆菌的对抗药物41.3热休克蛋白41.3.1热休克蛋白的简介41.3.2热休克蛋白90的结构51.3.3热休克蛋白90的功能6CRISPR/Cas系统7CRISPR/Cas系统的简介7CRISPR/Cas系统的结构8CRISPR/Cas系统的功能9CRISPR/Cas系统的作用过程91.5本研究的目的和意义102结核分枝杆菌HtpG蛋白的表达和纯化112.1实验材料112.1.1质粒112.1.2菌株112.1.3培养基112.1.4主要试剂112.1.5常用缓冲液及其它溶液122.1.6主要仪器132.2实验方法142.2.1Rv2299c基因编码的蛋白质生物信息学分析142.2.2Rv2299c基因的克隆142.2.3重组质粒pET28a-Rv2299c和pMV261H-Rv2299c的构建和鉴定162.2.4重组质粒pET28a-Rv2299c在大肠杆菌中的诱导表达与纯化192.2.5重组质粒pMV261H-Rv2299c在耻垢分枝杆菌的转化与鉴定202.2.6重组质粒pMV261H-Rv2299c在耻垢分枝杆菌中的诱导表达及WB鉴定212.2.7His-HtpG融合蛋白的结晶及初步衍射232.3结果和分析242.3.1Rv2299c基因编码的蛋白质生物信息学分析242.3.2结核分枝杆菌H37Rv基因组提取242.3.3目的基因Rv2299c的PCR扩增252.3.4pET28a-Rv2299c和pMV261H-Rv2299c重组载体初步验证252.3.5pET28a-Rv2299c和pMV261H-Rv2299c重组载体测序验证262.3.6His-HtpG融合蛋白的表达和纯化272.3.7蛋白质浓度的测定292.3.8重组质粒pMV261H-Rv2299c在耻垢分枝杆菌中的PCR鉴定302.3.9重组质粒pMV261H-Rv2299c在耻垢分枝杆菌中的诱导表达的WB鉴定312.3.10His-HtpG融合蛋白结晶及晶体的初步衍射分析312.4讨论323CrRNA的制备343.1实验材料343.1.1主要试剂343.1.2常用溶液343.1.3主要仪器353.2实验方法353.2.1目的基因的二级结构预测353.2.2模板的制备353.2.3引物的合成363.2.4目的基因的扩增和纯化363.2.5目的基因的转录37CrRNA的PAGE检测38CrRNA的纯化383.3结果和分析393.3.1目的基因的二级结构预测393.3.2目的基因的PCR扩增403.3.3目的基因的转录413.3.4目的基因的纯化413.4讨论423.4.1模板的制备423.4.2引物的合成423.4.3目的基因的PCR扩增433.4.4目的基因的转录和纯化434HtpG蛋白与CrRNA的结合作用444.1实验材料444.1.1主要试剂444.1.2常用缓冲液及其它溶液444.1.3主要仪器454.2实验方法45CrRNA的去磷酸化处理45CrRNA的同位素标记454.2.3标记后的RNA与蛋白的孵育464.2.4非变性的聚丙烯凝胶电泳检测464.2.5同位素放射自显影474.3结果和分析474.4讨论485结论与展望49参考文献50致谢58摘要目前由世界卫生组织报道，在2010年，全世界900万人患结核病，140万人死亡，而这其中95%发生在发展中国家。我国每年新发结核病人数占全球总数的17%，位居世界第二。因此,对于结核病的病原体——结核分枝杆菌——的致病机理以及免疫