番茄红素及维生素e对燃煤型氟中毒致大鼠睾丸组织中clusterin蛋白表达的影响及机制-effect and mechanism of lycopene and vitamin e on expression of cluster in testicular tissue of rats caused by coal-burning fluorosis.docxVIP

番茄红素及维生素E对燃煤型氟中毒致大鼠睾丸组织中Clusterin蛋白表达的影响及机制专业：外科学（泌外），研究生：田源，导师：孙发中文摘要目的：研究拟以燃煤型氟中毒病区玉米为饲料、建立动物中毒模型并利用抗氧化剂对燃煤型氟中毒致雄性性生殖损害进行干预，探索可能的干预机制；并比较不同抗氧化剂的作用，以寻找较为有效的治疗药物。方法：将30只雄性SD大鼠分为低氟组、中氟组、髙氟组、髙氟组+维生素E组、髙氟组+番茄红素组、对照组共六组动物模型每组5只。各染毒组喂饲含不同比例的燃煤型氟中毒病区煤烘玉米的饲料，构建燃煤型氟中毒动物模型,并在两个药物干预组中分别添加维生素E和番茄红素。于120d处死大鼠。采用HE染色，光镜下观察睾丸组织病理学改变；氟离子选择电极法检测大鼠尿氟含量；原位缺口末端标记（TUNEL）染色，观察生精细胞凋亡的情况；采用免疫组化法对大鼠睾丸组织中Clusterin蛋白表达进行定位、Westernblot法检测大鼠睾丸组织中Clusterin蛋白表达变化。结果：成功建立大鼠氟中毒模型。睾丸生精小管均发生不同程度的损害,120d时各染氟组大鼠尿氟含量均明显升高（P均0.01）。各染氟组大鼠睾丸组织Clusterin蛋白含量均明显降低（P0.05或P0.01），且随染氟剂量增加而降低，而两个药物干预组的含量要高于高氟组和中氟组（P0.05），而番茄红素组与低氟组无明显差异（P0.05）,维生素E组低于低氟组(P0.05)；番茄红素组表达量高于维生素E组(P0.05)。各染氟组单位生精小管细胞凋亡指数（AI）明显高于对照组（P0.05或0.01）；各染氟组生精细胞凋亡指数随染氟剂量的增加呈升高趋势，且各染氟组间差异具有统计学意义（P0.05）；而两个药物干预组的凋亡指数要低于高氟组（P0.05），而番茄红素组与中氟组无明显差异（P0.05）,维生素E组高于中氟组（P0.05）。对照组生精细胞偶见有凋亡发生结论：燃煤型氟中毒可引起大鼠睾丸内氧化系统与抗氧化系统失衡，生精细胞凋亡率增加；Clusterin蛋白的表达降低与氟中毒致睾丸生殖功能降低有着密切关系。抗氧化剂可显著提高Clusterin蛋白的表达，降低生殖细胞凋亡率，提高对氟中毒致生殖毒性损伤的拮抗作用，改善雄性生殖功能的损伤。关键词：燃煤型氟中毒；睾丸；氧化应激损伤；Clusterin；维生素E；番茄红素。英文缩略词表缩略词英文中文AIapoptoticindex凋亡指数SODsuperoxidedismutase超氧化物歧化酶IAintegralabsorbance积分吸光度LPOlipidperoxidation脂质过氧化反应HEhaematoxylinandeosinstain苏木精-伊红TUNELterminaldeoxynucleotidyltransferase-mediatedIODdUTP-biotinnickendlabelingIntegratedoptiondensity原位末端转移酶标记积分光密度值IPPImage-ProPlus6.0(IPP6.0)前言燃煤型氟中毒是我国特有的一种氟中毒，涉及贵州、云南、四川等14个省、市及自治区，200个病区县，34915个病区村，病区村人口达3430.36万人[1]。氟中毒对男性生殖的影响逐渐引起人们的高度重视。有研究表明，机体摄入过量氟可导致睾丸生精功能降低，使精液质量下降，不育率升高[2]。生精过程的各阶段都存在自发性和诱发性的生精细胞凋亡，病理状态下生精细胞过度凋亡将导致少精症或无精症的发生[3]。本课题组前期研究发现，过量氟导致大鼠睾丸生精细胞的结构和功能受损，生精细胞凋亡率增加，雄性大鼠生殖内分泌激素紊乱[4,5,6]。有学者在经饮水染氟和经腹腔注射氟化钠的研究中提出氧化应激可能是氟中毒机制中的一个重要环节，认为过量氟导致机体氧化系统/抗氧化系统失衡，氧自由基代谢紊乱，对靶器官组织产生了氧化应激损伤[7]。Clusterin蛋白是一种普遍存在于人体组织细胞中的异源二聚体硫酸化糖蛋白，其功能主要有辅助生殖、脂质转运、抑制补体介导的细胞免疫等，是近年来新发现的一种凋亡相关因子[8]。有研究发现在睾丸组织中Clusterin对生精细胞具有明显的抗凋亡作用，提示该蛋白可能与不育症的发生密切相关[9]。国内有学者研究发现番茄红素和维生素E对毒性物质对睾丸生殖功能损害具有一定的拮抗作用[10,11]，本实验采用贵州省六盘水市氟中毒病区煤烘玉米加工的饲料来复制雄性大鼠氟中毒模型，研究氧化应激在燃煤型氟中毒睾丸组织损伤中的作用，以期为氟生殖毒性机制的研究和防治提供理论依据。研究拟以燃煤型氟中毒病区玉米为饲料、建立动物中毒模型并利用抗氧化剂对燃煤型氟中毒致雄性性生殖损害进行干预，探索可能的干预机制；并比较不同抗氧化