非受体酪氨酸激酶c-abl通过cdc25c调控g2m转换的机理研究-study on the mechanism of non-receptor tyrosine kinase c - abl regulating g2m conversion through cdc 25c.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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非受体酪氨酸激酶c-abl通过cdc25c调控g2m转换的机理研究-study on the mechanism of non-receptor tyrosine kinase c - abl regulating g2m conversion through cdc 25c

目录缩略词表 1摘要 2Abstract4前言 61.细胞周期调控 62.Cdc25 磷酸酶家族的结构与功能73.c-Abl 激酶家族的结构与功能94.本课题研究的科学问题 10材料与方法111.菌株、细胞株及质粒 112.分子生物学工具酶 113.Cdc25C 全长基因的获得114.质粒构建及序列测定 115.质粒小提 126.谷胱甘肽 S 转移酶（GST）融合表达蛋白的制备137.细胞培养、冻存与转染 138.免疫沉淀与免疫印迹 149.蛋白浓度的测定 1510.体外结合实验 1511.体外磷酸酶活性检测 1612.细胞同步化实验 1613.细胞核、细胞质蛋白分离 1614.流式细胞术检测细胞周期 1615.细胞中总 RNA 提取及 RT-PCR1716.激酶分析实验 1717.其他 17结果 18 1.c-Abl 与 Cdc25C 之间存在直接相互作用 182.c-Abl 酪氨酸激酶可介导 Cdc25C 酪氨酸磷酸化修饰203. 利用串联质谱技术（LC-MS/MS）分析 c-Abl 介导的 Cdc25C 的酪氨酸磷酸化位点214.c-Abl 激酶介导的 Cdc25C 酪氨酸磷酸化可抑制 Cdc25C 的磷酸酶活性245. Cdc25C S216 位点磷酸化受 c-Abl 介导的酪氨酸磷酸化调节 266. Cdc25C 在细胞内的稳定性依赖 c-Abl 激酶活性 287.c-Abl 介导的 Cdc25C 酪氨酸磷酸化抑制细胞增殖并促进 G2/M 期阻滞 29讨论 32 1.c-Abl 酪氨酸激酶与 Cdc25C 之间的存在直接相互作用 322.c-Abl 激酶可介导 Cdc25C 酪氨酸磷酸化 323. c-Abl 介导的 Cdc25C 酪氨酸磷酸化抑制 Cdc25C 的磷酸酶活性 334.c-Abl 介导的 Cdc25C 酪氨酸磷酸化缺失导致 Cdc25C 阻滞在细胞质并降解 345.c-Abl 介导的 Cdc25C 酪氨酸磷酸化修饰可抑制细胞增殖并促进 G2/M 期阻滞 34结论 36参考文献 37文献综述 42发表论文 49个人简历 55致谢 56缩略词表缩略词表Abi Argc-Abl CDKs DKD DKO DMSO IBIP IR NES NLS ODPAGE PBS SH2 SH3 TKAbl interaction proteins Abl related gene Celluar-Abelson geneCyclin-dependent kinases Abl/Arg double knock down Abl/Arg double knockout Dimethyl Sulfoxide Immunoblot Immunoprecipitation Ionizing RadiationNuclear export signalNuclear Localization Sequence Optical DensityPolyacrylamide Gel Electrophoresis Phosphate-buffered salineSrc-homoloy 2Src-homoloy 3 Tyrosine kinaseAbl 相互作用蛋白Arg 蛋白c-Abl 蛋白细胞周期蛋白依赖性激酶 Abl/Arg 双干扰细胞 Abl/Arg 双敲除细胞二甲基亚砜免疫印迹免疫沉淀电离辐射核输出信号核定位序列吸光系数聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液Src 同源结构域 2Src 同源结构域 3酪氨酸激酶摘要摘要非受体酪氨酸激酶 c-Abl 广泛表达于各组织细胞中，通过相互作用及磷酸化修饰改变底物蛋白的生物活性，进而调控细胞的增殖与分化、细胞粘附迁移、细胞凋亡以及细胞的周期转换等生命过程。磷酸酶 Cdc25C 是调控细胞周期 G2/M 期转换的关键因子。在 G2/M 期阶段，被 Cdc25C 去磷酸化激活的 Cdk1/Cyclin B 复合体可同时反馈上调 Cdc25C 磷酸酶活性，这种正反馈信号放大效应使大量的 Cdk1/Cyclin B 复合体被激活，从而开启 M 期的分裂进程。我们前期研究发现，在离子辐射应激的条件下，c-Abl 参与调控细胞周期 G2/M 期阻滞。由于此过程中 Cdc25C 激活 Cdk1/Cyclin B 复合体的过程受阻，提示 c-Abl 激酶有可能通过 Cdc25C 调控 G2/M 转换，并在细胞周期阻滞中发挥作用。尽管已有研究表明 c-Abl 参与调控细胞 G1/S 期的转换，但 c-Abl 在细胞周期 G2/M 期转换中的作用尚不明确。此外， c-Abl 与 Cdc25C 之间的相互作用及调控关系也未见报道。本研究通过一系列免疫