肺癌患者癌组织和血浆timp-3 p16基因甲基化分析及去甲基化肺癌细胞生物学行为和timp-3基因转录的研究-methylation analysis of timp - 3 p16 gene in cancer tissue and plasma of lung cancer patients and study on biological behavior and timp - 3 gene transcription of deme.docxVIP

讨论……………………………………………………………………44结论……………………………………………………………………45参考文献………………………………………………………………46附录……………………………………………………………………48致谢……………………………………………………………………50综述……………………………………………………………………51英文缩略词表Abbreviation英文缩写NSCLC英文全称non-smallcelllungcancer中文名称非小细胞肺癌MSPmethylation-specific甲基化特异性聚合酶联反应polymerase-chainreactionPCRpolymerase-chainreaction聚合酶联反应TIMP-3tissueinhibitorof组织金属蛋白酶抑制因子-3metalloproteinases-3dNTPDeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸EBEthidiumbromide溴化乙锭EDTAEthylenediaminetetraceticacid乙二胺四乙酸TAETris-acetate-EDTATAE缓冲溶液minminute分钟PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠RpmRotationspeedperminute每分钟转速OROddsRatio优势比PProbability概率EPEppendorf离心管DEPCDiethylpyrocarbonate焦磷酸二乙酯AAbsorbance吸光度RT-PCRReversetranscriptasePoly-逆转录聚合酶联反应FAmerase-chainreactionfolicacid叶酸肺癌患者癌组织和血浆TIMP-3、p16基因甲基化分析及去甲基化肺癌细胞生物学行为和TIMP-3基因转录的研究(总摘要)目的研究非小细胞肺癌（NSCLC）患者癌组织和血浆TIMP-3、p16基因甲基化及其临床意义；用不同浓度的去甲基化药物叶酸（folicacid,FA）处理比较有代表性的人肺腺癌细胞A549，观察其增殖、分化、侵袭和转移等生物学行为，检测抑癌基因TIMP-3甲基化状态及其mRNA转录水平，为叶酸应用于肺癌的临床治疗提供依据。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）技术，检测110例NSCLC患者癌组织、癌旁组织和外周血血浆TIMP-3、p16基因的甲基化状态，并对110例正常对照组血浆样品进行同样检测，各组检测结果进行比较。分别用含FA终浓度为15、75、375、1875nmol/L的培养基处理人肺癌细胞株A549，MTT实验检测FA在不同浓度和作用时间对A549细胞增殖能力的影响；细胞粘附实验检测不同浓度的FA对A549细胞粘附能力的影响；平板细胞克隆形成实验检测不同浓度的叶酸对A549单细胞克隆形成能力的影响；细胞迁移抑制实验检测不同浓度的叶酸对A549细胞迁移能力的影响；RT-PCR和MSP方法检测不同浓度的FA对TIMP-3基因mRNA表达水平和启动子区甲基化水平的影响。结果NSCLC患者癌组织中TIMP-3、p16、联合检测的基因甲基化率分别为26.7%、44.2%、59.2%，分别高于癌旁组织的6.5%、11.7%、14.2%（P0.01）；外周血血浆中TIMP-3、p16、联合检测基因甲基化率分别为13.3%、32.5%、40%，正常对照组血浆未检测到两种基因甲基化（P0.01）；血浆中TIMP-3、p16和联合检测的基因甲基化检出率与NSCLC临床分期、临床分类以及病理类型均无统计学差异（P0.05）。在15、75、375nmol/L浓度范围内，叶酸对肺癌A549细胞的一些生物学特征，如增殖活性、单细胞克隆能力、细胞粘附能力、迁移能力都有明显的抑制作用，且具有一定的剂量效应。而浓度升到1875nmol/L时，叶酸的抑制作用降低。在15、75、375nmol/L浓度范围内，叶酸能够使TIMP-3基因去甲基化，使其转录活性提高。结论对NSCLC患者癌组织和外周血浆TIMP-3、p16基因甲基化的检测为肺癌的筛查和鉴别诊断提供有价值的参考信息，并且联合检测可提高肺癌的检出率。启动子的异常甲基化是人肺癌细胞株A549中TIMP-3基因失活的可能原因，而叶酸能够逆转或部分逆转TIMP-3基因的甲基化状态，为叶酸应用于肺癌的临床治疗提供了依据。关键词TIMP-3/p16/非小细胞肺癌/甲基化特异性聚合酶链反应/叶酸/DNA甲基化/DNA去甲基化MethylationofTIMP-3andp16geneinplasmaandtissuesfromnon-smallce