芋螺多肽eb1.6的合成工艺分析及质量研究-study on synthesis and quality of conocophillips polypeptide eb 1.6.docx

芋螺多肽 Eb1.6 的合成工艺研究及质量分析摘要Eb1.6（GCCSNPACMLKNPNLC-NH2）是本课题组从中国南海西沙群岛黑 星芋螺克隆得到的新型α-芋螺毒素，该肽含有 16 个氨基酸，两对二硫键。前期 研究表明，该肽对神经病理性疼痛具有很强的镇痛作用，其镇痛活性显著高于目 前已进入临床阶段的镇痛药 Vc1.1，作用时间更长且不成瘾。Eb1.6 给药方便， 肌肉注射或静脉注射均可，可用于局部及全身镇痛。本课题开展 Eb1.6 的规模合 成及质量分析，为其进一步临床应用奠定基础。本论文完成了如下几个方面的工作：（1）采用多肽固相合成法手工合成了六 批α-芋螺毒素多肽 Eb1.6 线性肽，并对线性肽进行了折叠、富集、纯化；（2） 参考《中华人民共和国药典》2010 年版二部、多肽及化学药物研究指导原则、 相关文献，研究了 Eb1.6 原料药质量分析方法，如理化常数的测定、鉴别试验、 纯度分析、含量测定和稳定性研究等；（3）探索了 Eb1.6 的制剂处方。本论文的主要成果：1. Eb1.6 的规模合成工艺首先采用仪器合成的方法尝试了 8 种树脂、4 种缩合剂，筛选出了适用于Eb1.6 规模合成的条件。试验表明采用 Rink amide 树脂（0.60 mmol/g）和缩合剂（DIC/HOBt）可获得高合成收率的 Eb1.6。为获得廉价及折叠效率高的缓冲体系， 本文探索了 Eb1.6 的折叠条件，在获得的优良折叠体系（pH=8.0 的 0.1 mol/L NH4HCO3 缓冲体系）下，Eb1.6 线性肽主要形成一种产物。为降低纯化成本，本 文采用廉价的 Amberlite XAD16 大孔吸附树脂吸附折叠肽，经乙醇浸洗及旋转蒸 发浓缩得折叠后粗品，此方法可实现缓冲体系及树脂的反复循环使用，回收率较 高（80%）,显著降低了成本。粗品经反相高效液相色谱纯化后纯度大于 98.25%， 产品符合药品申报要求。2. Eb1.6 原料药的质量分析（1）理化常数测定了 Eb1.6 的溶解度、比旋度等理化常数，进行了氨基酸组成、序列及质 谱分析，证明其一级结构与理论结果一致。（2）鉴别试验通过化学、高效液相色谱、紫外光谱、质谱四种方法对原料药进行了鉴别试 验，表明了四批样品的正确性。（3）纯度分析和含量测定 有关物质：通过对不同色谱柱进行一系列等度及梯度洗脱的探索，得到了适合 Eb1.6 质量分析较理想的色谱条件。通过专属性、系统适用性、耐用性、准确 度、精密度、线性、最小检测限及最小定量限验证了方法的有效性。专属性试验 通过酸、碱、氧化、高温及光照破坏五种条件进行，降解产物能很好地进行分离 分析。通过改变检测波长、流速、柱温及流动相 pH 值验证了方法的耐用性良好。 平均回收率、最小检测限、最小定量限、日间和日内精密度依次为 101.115%，4 μg/mL，2.12 μg/mL，0.52%，1.31%，线性回归方程为 Y = 6984.7 X–118.07， R2 = 0.9998，横坐标 X 为 Eb1.6 的浓度，纵坐标 Y 为峰面积。结果三批样品（批 号20130102多肽含量依次为 98.95±0.49、98.39±0.02 、98.43±0.44，总有关物质含量在 1.08%～1.34%之间。 水分含量测定：采用容量法（Karl Fischer 滴定法）测定 Eb1.6 对照品及三批样品中的水分含量。测试结果分别为 2.3%±0.05%、2.1%±0.06%、2.1%±0.11% 、2.3%±0.12%，均小于 5.0%。醋酸及三氟乙酸含量测定：采用反相高效液相色潽法测定 Eb1.6 四批样品中 的 HAc 及 TFA 含量，考察了分析方法的适用性、线性范围、精密度等，测得了 四批 Eb1.6 样品中 HAc 含量分别为 6.80%，7.58%，8.36%，8.66%，未检出 TFA。内毒素试验：按照《细菌内毒素检查标准操作规程》进行操作，测得四批 Eb1.6 样品的内毒素含量分别为批低于 1.0 EU/mL批低于 1.0 EU/mL批低于 1.25 EU/mL批低于 1.25 EU/mL，均小于 2.5 EU/mL，符合药物申报要求。 重金属含量测定：采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定三批样品中的重金属（Ag、Pb、As）含量，结果均小于 0.06 ppm，符合药物申报要求。（4）稳定性试验：正在进行 Eb1.6 原料药影响因素试验（高温、高湿和强 光照）、加速试验和长期试验试验。根据质量研究结果，初步制订 Eb1.6 原料药的质量标准草案。3. Eb1.6 制剂处方的研究考察