分子生物学实验基础4hPPT.ppt

分子诊断学;第一章 序论 ;第一节 概述;1.内源基因异常的检验和诊断;2.外源基因侵入体内检测及诊断;第二节 分子生物学实验基础 ;基因重组(Genetic recombination);基因重组的方式;转导（Transduction） 利用载体把遗传物质从一种宿主传给另一宿主的过程。 转位（Transposition） 一个或一组基因从一处转移到基因组的另一位置的过程，这些游动的基因称为转位子(Transposon)。 ;遗传工程; 重组DNA技术相关概念 　　 DNA克隆 克隆（clone）： 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 克隆化（cloning）： 获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。 分子克隆（DNA克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）;基因工程（Gene engineering） ;DNA克隆： 　　 应用酶学的方法，在体外将各种来源的 DNA与载体DNA结合成具有自我复制能力的 DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞， 筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行 扩增、提取获得大量同一DNA分子。又称基 因克隆或重组DNA。;1972年 P.Berg etc首次用EcoRI切.接SV40和λphageDNA构建第一个人工DNA分子.获1981年诺贝尔化学奖;　;分离纯化或人工合成带有目的基因的DNA片段； 在体外将目的基因与载体DNA结合，成为重组 DNA分子； 将重组DNA导入到适当的受体细胞，并与之一起增殖；同时筛选出带有重组DNA分子的受体细胞克隆； 从筛选出来的受体细胞克隆中，提取目的基因供进一步分析研究使用； 将目的基因克隆到表达载体并导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下，实现功能表达。;二、基因工程的常用工具; 能够独立自主的复制，且目的基因的插入不影 响载体的复制能力； 具有至少一个单一酶切位点； 具有显著的遗传标记，便于筛选； 供插入外源基因的片段范围大，且能稳定存在； 载体本身分子量小，拷贝量高； 安全。 ;按来源分 质粒（plasmid） 噬菌体（phage） 病毒（virus）;4、质粒;(3)命名 eg：pBR322;;;　;pBV220; 优点： 1. 个体较小（几个kb），易于获得； 2. 含有显著的遗传标记通常有2个以上； 3. 拷贝数高； 4. 易于导入外源基因，易于进入宿主细 胞并稳定存在； 缺点：可插入的外源片段小10kb以下。;5、噬菌体载体;.噬菌体（phage）DNA 　　 λ 噬菌体DNA改造系统 λ gt 系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） M13噬菌体DNA改造系统（含lac Z基因） 　 M13mp系列 　 pUC系列; 柯斯质粒（cosmid） 酵母人工染色体载体 （yeast artificial chromosome, YAC） 细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome, BAC） 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录 病毒）;（二）工具酶;1、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） ; 　　识别DNA的特异序列，并在识别位 点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 　　 是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。II类酶识别序列特点为回文结构。 ··· ··· GGATCC ··· ··· ··· ··· CCTAGG ··· ··· ;;活性单位 在一定的反应条件下（pH、温度、离子浓度等）和时间内(60分钟)能够完全酶解1μg的DNA分子底物所需的酶量 ; 两条链上的断裂位置是交错的、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，形成所谓粘性末端DNA片段 EcoRI ↓ 5’－G┆AATT C－3’ 5’－G AATTC－3’ 3’－C TTAA┆G－5’ 3’－C TTAA G－5’ ↑ PstI