第六章蛋白质工程PPT.ppt

对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫切需要和重要任务。 一、 蛋白质组学的概念 蛋白质组学（Proteomics） 定义1： 阐明生物体各种生物基因组在细胞中表达的全部蛋白质的表达模式及功能模式的学科。包括鉴定蛋白质的表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能和相互作用等。 所属学科： 生物化学与分子生物学（一级学科）；总论（二级学科） 定义2： 研究基因组编码的全部蛋白质的结构、性质和功能的学科。 所属学科： 细胞生物学（一级学科）；总论（二级学科） 定义3： 研究细胞内全部蛋白质的组成、结构与功能的学科。 所属学科： 遗传学（一级学科）；总论（二级学科） 蛋白质组学(proteomics) 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 蛋白质组 蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合,意指proteins expressed by a genome，即“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。 荧光染色的细胞内蛋白质 二、蛋白质工程的改造策略与方法 (1)疏水性氨基酸常常出现在蛋白质的活性中心区域；α-螺旋和β-折叠区通常不会是酶的活性中心或配体以及底物结合的中心，而是作为结构的支架；环(Loop)区、转角(turn)区域和带电荷区域通常位于蛋白质的表面。基于这种经验，在设计突变时要注意保留脯氨酸或半胱氨酸残基。因为脯氨酸常被用来终止α螺旋区，而半胱氨酸酸常形成起稳定作用的二硫键，同时二硫键又是许多分泌性蛋白的标志。 (2)进行定点突变时，应注意保守氨基酸残基。如果要改变酶活性、底物结合活性等高度特异性的性质，则应尽量保留保守残基。 (3)应注意保留潜在的N糖基化位点（Asn-X- Ser /Thr-X-Pro) 中的Asn(天门冬酰胺)、Ser(丝氨酸)或Thr(苏氨酸)。在很多情况下，特别是分泌性蛋白和穿膜蛋白，能否正确糖基化对蛋白活性物影响很大。 (4)对于含有内含子的序列，可以删除某一外显子或外显子组合，因为单个外显子通常编码独立折叠的结构域，删去该结构域后可能不会影响蛋白其余部分的正确折叠。 二、蛋白质工程的改造策略与方法 二、蛋白质工程的改造策略与方法 (5)构建两个同源蛋白的嵌合体时，应尽量使其接合部位处在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；而当两个非同源蛋白组成嵌合体时，则应使接合部分尽量位于所预测结构的边缘。 (6)如果对目的蛋白的三维结构一无所知，那么可以在目的序列中随机插人六聚体接头以鉴定功能件结构域。插人六聚体接头后，在原蛋白质序列中添加两个氨基酸，比插人更多的氨基酸对蛋白质整体功能的破坏要轻。 (7)进行缺失突变时，应避免直接利用天然存在的限制性酶切位点进行删除。如果直接利用这种限制性内切酶位点，很容易破坏正确的开放读码框，或得到的缺失突变体边界不能落在适当的位置，而使蛋白质不能正确折叠。 第二节 蛋白质研究方法 蛋白质工程研究的内容是以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计把蛋白质改造为有预期的新特征的突变蛋白质，在基因水平上对蛋白质进行改造，按改造的规模和程度可以分为：①个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的删除、置换或插入(初级改造)；②蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接(高级改造)；③从头设计合成新型蛋白质。 一、初级改造 为了实现氨基酸的置换，需要采用DNA碱基突变的方法，改变编码氨基酸的密码子，以达到改变氨基酸进而改造蛋白质的目的。 蛋白质工程研究中主要采用的基因突变方法包括基因定位突变和盒式突变。 一般，含有单一或少数几个突变位点的基因定向改变可以采用M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术、寡核苷酸介导的PCR诱变技术、随机诱变技术和盒式突变技术，而大面积的定位突变则需要采取基因全合成的方法。 寡聚核苷酸介导诱变技术 寡核苷酸介导的PCR诱变技术 克隆基因的随机诱变 盒式突变技术 二、结构域的拼接（蛋白质分子的高级改造） 蛋白质分子种类繁多，结构复杂，其分子大小、形状也各个相同。在结构，通常认为，蛋白质分子的一级结构氨基酸序列一定规则构成二级结构，再由二级结构折叠成三级结构。研究证明，在二级结构和三级结构之间，还有一个结构层次，即结构域(domain)。 结构域是由α螺旋、β折叠等二级结构单位按一定的拓扑学规则构成的三维空间结构实体。有些小分子量的蛋白质分子，如蝎毒、蛇毒和蜘蛛毒素等多肽类神经毒素，只包含一个结构域，而大部分蛋