第六章蛋白质翻译后修饰的鉴定PPT.ppt

1、MALDI-TOF-MS的应用 去糖基化处理的质谱分析图 去糖基化的单电荷峰，图谱变得简单且峰形尖锐 去糖基化的双电荷峰 完整的未发生去糖基化的单电荷峰 1、MALDI-TOF-MS的应用 经唾液酸酶去唾液酸化处理的质谱分析 去唾液酸化的单电荷峰 去唾液酸化的双电荷峰 非特异性降解产物 1、MALDI-TOF-MS的应用 糖基化类型及糖基化位点的确定 寻找质谱图上峰的位移 从位移峰的肽段序列中，寻找出可能连接糖链的氨基酸 2、LC-ESI-Q-TOF-MS 糖链结构的分析 串联质谱的母离子扫描技术 选择特定的糖链离子，经碰撞活化使用惰性气体将其打碎，从而推断糖链结构 如人血清转铁蛋白的糖链结构分析 选择以HPLC分离的一个糖链，其分子离子双电荷[M+2H]2＋在电喷雾串联质谱中为823.8，将其设为母离子，以惰性气体与其碰撞产生碎片 2、LC-ESI-Q-TOF-MS 糖链结构的分析 2、LC-ESI-Q-TOF-MS 糖链结构的分析 中性丢失 3、凝集素在糖蛋白分析中的应用 伴刀豆蛋白（ConA）对高甘露糖型N-糖链有专一性 麦胚凝集素（WGA）对杂合型N-糖链有专一性 兵豆凝集素对亲和核心岩藻糖类糖链有专一性 糖蛋白结构质谱解析 母离子 糖蛋白结构质谱解析 由于N-糖蛋白壳二糖核心中与天冬酰胺连接的乙酰葡萄糖胺残基会在碰撞过程中发生跨环断裂，先后产生质荷比相差120，80的中性碎片丢失，这两个碎片是发现糖基化位点及糖肽氨基酸序列的标志 糖蛋白结构质谱解析 图 利用MALDI-TOF/TOF谱图鉴定磷酸化肽段 a: 酶切产物的一级质谱图。磷酸化肽段的质谱峰用星号标出, 其相对未磷酸化肽段的理论分子量位移80 Da (HPO3 = 80 Da); b: a中标记星号的质谱峰的二级质谱分析。在图中可见比母离子小98 Da (H3PO4 = 98 Da)的中性缺失峰  串联质谱(MS/MS) 前体离子扫描 通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷酸肽的存在；磷酸化肽经CID（碰撞诱导解离）后会产生磷酸基团的特异性片段，这些特异性的片段在用串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽的“报告离子” 前体离子扫描 在三级四级串联质谱采用 使各种质荷比的离子依次通过Q1分析器，Q2为碰撞诱导解离室，将Q3分析器的电压和频率设定为只能传输某一特定质荷比，即特定质荷比的子离子 直接检测在碰撞诱导解离过程中丢失的碎片离子 前体离子扫描 分析磷酸肽 负离子模式 设定Q3中仅能通过的子离子质荷比m/z 79，即磷酸肽丢失的PO3-，这样得到的质谱图仅显示丢失m/z 79的离子的谱峰 丢失磷酸根离子的磷酸肽谱峰 多肽产生的各种碎片离子中，质量数在79Da附近的几乎没有 中性丢失扫描 具有两级质量分析器和碰撞诱导解离室的串联质谱仪 Q1和Q2同步扫描，但扫描范围不一样，保持一个特定的电压差值，这个电压差所代表的质荷比m/z值代表一个中性分子的质量 将Q1输送来的离子碰撞诱导裂解，再将碎片离子送入Q3 只有在Q2中诱导裂解后能丢失这一特定中性分子的离子才会被Q3传输到检测器 中性丢失扫描 分析磷酸肽 从带一个正电荷的[M+H]+肽混合物中寻找丢失中性磷酸分子H3PO4的磷酸肽，则Q1和Q3的扫描电压差所代表的质荷比应为m/z 98 从带两个正电荷的[M+2H]2+肽混合物中寻找丢失中性磷酸分子H3PO4的磷酸肽，则Q1和Q3的扫描电压差所代表的质荷比应为m/z 49 只能分析磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸 3、磷酸化氨基酸位点的确定 用于确定磷酸化肽中磷酸化位点的质谱方法基于两种不同原理 第一种方法取决于磷酸酯键的化学稳定性 如在ESI质谱仪的碰撞室或离子源中，或在MALDI—MS的源后裂解（PSD）过程中磷酸化肽可通过磷酸酯键断裂产生的碎片离子鉴定 第二种方法基于肽段增加的磷酸酯基团的质量数 如果蛋白是已知的，可通过质量数来确定肽段 在某些情况下，肽段只含有一个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，则很容易找到磷酸化位点，但在大多数情况下肽段含有许多个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，则确定磷酸化位点发生困难 五、蛋白质磷酸化的定量分析 定量：磷酸化蛋白与其对应的非磷酸化蛋白质的比例 研究的蛋白样本酶切后等分成两部分, 一部分直接用CH3OH甲酯化, 另一部分经过磷酸酯酶处理后用CD3OH甲酯化, 随后将两者混合进行串联质谱研究, 即可得到磷酸化肽段的磷酸化水平的定量信息 该技术设计巧妙, 但甲酯化的效率可能会影响定量结果 一种基于稳定同位素标记的分析技术SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cell culture) 采用含有轻同位