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人巨细胞病毒潜伏激活感染诊断的进展_1课件
免疫组织化学技术 IHCT—Immunohistochemistry technique 定义:在组织细胞原位,通过抗原/抗体反应 和组织化学的呈色反应,借助可见的标 志物,对被检测抗原/抗体进行定性、 定位和定量检测的免疫学测定技术。 特点:结免疫学反应特异性和组织化学可见 性为一体;借助先为显微镜放大,于细 胞或亚细胞水平测定抗原/抗体。 免疫组织化学技术 类型:酶免疫组化技术 荧光免疫组化技术 免疫电镜技术 亲和免疫组化技术 (标记物等的不同) 实例: 一、免疫组化技术介绍 (一)标本制作 (二)抗体的选择 (三)抗原/抗体反应 (四)改善标本的通透性 (五)对照项的设立 (六)检测结果的判断 (一)标本制作 标本— 指固定在玻片上用作为抗原的,如 组织、细胞或微生物。 标本的类型—组织切片、印片、涂片。 1.印片法: 优点:操作简单,抗原保存好缺点:细胞厚薄不均,IHC染色易引起背 景染色。 2.组织切片 组织切片---冷冻切片/石蜡切片介绍: 特点:组织新鲜、速冻,恒温冷冻切片机 片厚5~10μm,-20℃保存;后者只 要求固定的标本,经脱水+浸蜡包埋 常温切片机,片厚2~3μm~ 优点: 前者抗原丢失少,结构保证完好; 后者片薄观察结构清晰,宜连续性可 作回顾性研究。 缺点: 前者细胞清晰度差,现用难保留;后 者抗原量少,易出现非特异着色,需 前处理。 1).切片前的准备工作(1)载玻片的清洁:市售载玻片需经清洁液泡24h,流水冲洗,系列乙醇浸泡,凉干涂胶。 (2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸(分子量300KD):0.5%浓度。 APES试剂(3-氨基、丙基三氧基硅烷):干净载玻片→丙酮5min →APES(1ml+50ml丙酮):用镊子夹住浸入APES试剂1~3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好,室温或4℃保存备用。 切片要求及注意事项: (1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)52-60℃烤片18h。 (3)切片厚2~4μm。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4℃保存数年(石蜡切片) 标本的固定 标本固定需达到目的:细胞内蛋白凝固 终止胞内酶活性 保持细胞固有态 除干扰性类脂等 理想固定剂:能快速固定细胞抗原 防止抗原物质扩散 固定后抗原的特性不改变 例:10%中性福尔马林液、丙酮、乙醇 标本的保存(温度、时间) 1.冷冻保存:2.新鲜组织经适当固定后,装入冻存管 中,-80℃冻存。3.蜡块的保存4.活细胞的保存 可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上,9孔板上的细胞可经固定后-80℃保存备用,大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。 标本的预处理(目的、注意点) 为什么要进行酶消化和抗原修复? 醛键形成 羧甲基形成 甲醛使蛋白质发生凝固,自身和之间会发生交联,交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变,使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变,而影响检测。 抗原修复(Antigen Retrieval;AR) 1 酶消化 (1)原理: 1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白 2)断交联 (2)蛋白酶的种类 胰蛋白酶 0.05%~0.1%胰蛋白酶加入等量的氯化钙,用0.1N NaoH调pH至7.8。消化时间37℃ 30min。 胃蛋白酶 0.4%胃蛋白酶,用0.1N HCI稀释,消化时间37℃ 30~180min。 蛋白酶K 20μg/ml,用pH8.0 0.5M Tris-HCI配制,消化时间37℃ 20~40min。 链酶蛋白酶 0.1%,用pH 7.4,0.5M Tris-Hcl稀释,消化时间37℃ 1~4h。 无花果蛋
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