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人源肠内菌转化通脉方化学研究 　　[摘要] 研究人源肠内菌转化“通脉方”的化学成分。采用硅胶、Sephadex LH-20、半制备性高效液相等柱色谱和重结晶等方法进行分离纯化，根据MS和NMR等谱学数据鉴定化合物的结构。分离鉴定了26个化合物，分别为苯丙酸（1）、6″-O-乙酰基葛根素（2）、芒柄花素（3）、大豆苷元（4）、对羟基苯丙酸（5）、吲哚-3-丙酸（6）、染料木素（7）、异芒柄花素（8）、异芒柄花苷（9）、（-）-野葛醇B-2″-O-吡喃葡萄糖苷（10a）和（+）-野葛醇B-2″-O-吡喃葡萄糖苷（10b）混合物、8-羟基大豆苷元（11）、野葛醇A（12）、3′-甲氧基-6″-O-乙酰基葛根素（13）、6″-O-乙酰基大豆苷（14）、3′-甲氧基大豆苷（15）、野葛醇B（16）、3-甲基尿嘧啶（17）、染料木苷（18）、大豆苷（19）、3′-甲氧基葛根素（20）、葛根素芹菜糖苷（21）、獐芽菜苦苷（22）、大豆苷元-7，4′-O-双葡萄糖苷（23）、腺嘌呤（24）、3′-羟基葛根素（25）和葛根素（26）。“通脉方”经人源肠内菌生物转化，所含苷类化合物被转化为苷元和/或少糖基化合物，亦包括羟基化反应和脱甲基反应；苷类化合物是“前药”。 　　[关键词] 通脉方；人源肠内菌；异黄酮；葛根素；大豆苷元；“前药” 　　“通脉方”由葛根、丹参和川芎等3味中药按重量比1∶1∶1组成，《中华人民共和国卫生部药品标准》·《中药成方制剂》收载的制剂有“通脉冲剂”[1]和“通脉口服液”[2]。国家食品药品监督管理局（SFDA）批准的“通脉颗粒”新药畅销市场，获批生产的药企有100余家。“通脉方”具有活血通脉之功效，用于缺血性心脑血管疾病、动脉硬化、脑血栓、脑缺血、冠心病、心绞痛等。为将其二次开发为精制“通脉颗粒”，本课题组首先对由原生药组成的“通脉方”的物质基础进行了研究，分离鉴定了34个化合物[3-4]。鉴于口服中药的某些化学成分在肠内可能由肠内菌进行生物转化，然后吸收进入体循环发挥生物学作用[5-7]，本文采用人源肠内菌生物转化模型[7]对与前期研究[3-4]同批次的“通脉方”进行生物转化，并研究转化产物的化学成分，为其药效物质基础的确定和其质量标准的制定提供实验依据。 　　1 材料 　　1.1 药品与??剂 人源肠内菌丛培养基材料主要为胰蛋白胨、牛肉膏、牛肝浸出粉、消化血清粉、朊胨和L-半胱氨酸盐酸盐（北京双旋微生物培养基制品厂），酵母浸膏购自Unipath Ltd.（Balingstoke，Hampshire，England），硫代乙醇酸钠（广西新港化工厂），可溶性淀粉（成都宏博有限公司），葡萄糖（北京化工厂）。 　　葛根、丹参和川芎药材（由神威药业有限公司提供）经北京大学药学院杨秀伟教授鉴定，分别为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.） Ohwi的干燥根、唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎、伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，凭证标本存放于北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室。 　　薄层色谱硅胶GF254（青岛海洋化工厂产品），反相C18硅胶板（Merck，Darmstadt，Germany），聚酰胺薄膜和柱色谱聚酰胺（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂生产），柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂产品），Sephadex LH-20（Pharmacia，Fine Chemicals，Inc.，Piscataway，N.J.，USA），AB-8大孔吸附树脂（天津市海光化工有限公司产品）。 　　乙醇、甲醇、环己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、丙酮等分析纯试剂均购于北京化工厂；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈基团有限公司），用前过0.45 μm有机微孔滤膜。薄层色谱检识用10%浓硫酸乙醇溶液和10%AlCl3乙醇溶液为喷雾剂，在紫外灯254，365 nm波长下观察。 　　1.2 仪器 Bruker AVANCE III 400型超导核磁共振波谱仪（Bruker BioSpin AG Facilities，Fllanden，Switzerland）；1H-NMR，400 MHz；13C-NMR，100 MHz；四甲基硅烷为内标。ESI-TOF-MS用MDS SCIEX API QSTAR型质谱仪（Applied Biosystems/MDS Sciex.，Foster City，CA，USA）测定；EI-MS用Finnigan TRACE 2000型质谱仪（Thermo Finnigan，San Jose，CA，USA）测定。半制备型高效液相色谱仪，配置P3050泵，UV3000紫外-可见光检测器，CXTH-3000工作