酿酒酵母的重组及其消化道途径转基因过程分析-recombination of saccharomyces cerevisiae and analysis of transgenic process of digestive tract pathway.docx

摘要要消化道途径非病毒草基因治疗具有方便、安全和易于推广的特点，被认为是基因治疗应用于临床的一种理想模式，具有巨大的市场前景。寻找可靠，实用，天然的基因药物载体系统，研究其作用机制，是消化道途径养病毒篓I!l治疗获得突破性进展的关键。为探索酿酒酵母作为基因运送载体以消化道途径转基因的可能性，本研究采用建立在通用载体质较融合系统(Uni-vectorplasmid-fusionsystem，UPS)上的Echo系统，分别构建了两种以绿色荧光蛋白CGFP)为报告基因的酿酒酵母附加里重组质粒。其中一矜是酿酒酵母伊哺乳动物缀饱穿梭质粒PYES-CMV-GFP，另一种为酿酒酵母表达质粒pYES-GFP。以常规的醋酸银化学法将所构建的重组质粒对酿酒酵母细胞进行转化，在尿堵军主缺陷型豹培养平被上筛选出阳性转化子，经鉴定获得分别携带pYES-CMV-GFP，pYES-GFP的运组酿酒酵母。经过不同碳源培养后发现z携带pYES-CMV-GFP的蒙组酿酒酵得没有GFP基因的表达:而携带pYES-GFP的重级酿酒酵母经半乳糖涝导后表达GFP。所构建的两种质粒经酵母近100代培养后仍未发生丢失，具有良好的稳定性。以脂质体介导pYES-CMV-GFP对不闵哺乳动物缀胞的转染.GFP得到表达，证明酿满酵母幡哺乳动物细胞穿梭载体构建成功:制备pY巴S-GFP在酿酒酵母细胞经诱导表达后转录的mRNA.RT-PCR鉴定后以黯质体介导其对不同动物细胞的转染，在不同时间后均观测到GFP的绿色荧光，证明重级酿酒酵母mRNA对动物细胞具有种属通用性。以Balb/cIJ\鼠为滚需实验动物模型，通过ELISA实验检测动物体内抗GFP特异性抗体的产生，采用免疫组化实验鉴定组织中GFP的表达。根据管饲材料不同进行实验分组2第1组为空白对照组:第2缀管f，lJ酿溶酵母INVScl;第3级管饲携带pYES-CMV-GFP的重组酿酒酵得:第4组管饲携带pY巴S-GFP{8未经诱导表达的重组摆在酒酵母，第5组管饲经诱导表达GFP的室主组酿滔酵母;第6组管饲经诱导表达GFP并破壁除去RNA的重组酿酒酵悖。结果发现:在第3组实验小鼠外周血清及小肠提取液中产生了抗GFP的IgG、IgA抗体，且抗体水平与七2对照您格比，存在显著fl差异(P0.05)。同时，该组有小鼠小肠、肝和膊组织的GFP免疫组化检测呈阳性，而l、2对照组小鼠各组织中GFP的表达皇阴性a说哥哥::!I主经曾在酒酵母哥哥携带的pYES-CMV-GFP在小鼠体内经转录、草草i幸得到表达。另外，第5组小鼠外周血清及小肠提取液中抗GFP的IgG、IgA抗体水平明显高于1、4对照、组(PO.05)om与第6组相比，不存在显著性差异(PO.05)。同时，经免疫级化实验发现:与1、4和6对照级相比，只有第5级有小鼠的小肠组织免疫组化检测呈阳性。提示:携帘pY巳S-GFP的宣言组酿酒酵母经诱导表达后，Vlll华南理工大学工学博士学位论文其中的mRNA可能进入小肠毅膜细胞，被识别并翻译IflGFPo根据实验结果z以酿酒酵母作为外源主主因载体，能够实现消化遗途径转基因，为以此进行深入的消化道途径基因治疗提供了新的技术平台，并为消化滋途径基因治疗药物的研究及开发提供了新思路。关键i词z基因治疗消化道途径黎因运送载体酿酒酵母GFPIXABST民ACTAbstractNon-vìralgenetherapythroughdìgestivetract(orthenon-viraldigestive-tract-routegenetherapy:NDG)canbeanexpedìent，saferandpracticaltechnology，exhibitinggreatpotential岳othìnclinicalprospectsandintheoretìcalstudìes.ThecriticalstepinNDGistofindreliable，feasibleandnaturalgenedeliveryvehicle.Inthisstudyrecombínantyeastwasusedasgenedeliveryvehiclestogetherwíththeplasmidsconstructedasdifferentexpressionvectors.Onlythroughelucidatingthemechanismofgenetransfersystem，couldbreakthroughinNDGbemade.ToexploretheapplicabilìtyofthεS.cerevisi在e在sNDGgenedeliveryvehi♀les，Uní-vectorplasmid-fusionsystem(UPS)hasbeenappli