甲醛致大鼠鼻腔癌与K-ras癌基因活化相关.docVIP

甲醛致大鼠鼻腔癌与K-ras癌基因活化相关 　　摘 要：为探讨甲醛致大鼠鼻腔癌的分子机制，对甲醛诱发的大鼠鼻腔癌细胞系FAT7中的转化序列进行检测。采用的实验方法，包括肿瘤细胞DNA与选择标志基因(neo)共转染、裸鼠成瘤性分析、Southern杂交、聚合酶链反应(PCR)和序列分析等。结果发现：在第二轮裸鼠肿瘤DNA中含有大鼠源性的K-ras基因序列，而无大鼠源性的H-ras、N-ras和p53基因序列。这表明甲醛诱发的大鼠鼻腔癌细胞系FAT7中所含的转化序列与H-ras、N-ras及p53基因无关，K-ras癌基因的活化可能参与甲醛致大鼠鼻腔癌。 　　关键词：甲醛；大鼠：鼻腔癌；K-ras：癌基因 　　中图分类号：R730 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007―7847(2006)01―0071―06 　　甲醛是一种工业用途十分广泛的化学物质， 在人们日常生活环境中也大量存在。对甲醛的 致癌性进行流行病学、毒理学、病理学研究，发现 甲醛可引起染色体异常、基因缺失、基因突变、细 胞转化，长期慢性吸人甲醛可诱发动物肿瘤等， 但甲醛致癌的具体机制迄今仍不清楚，因此甲醛 被列为潜在致癌物。为了探讨甲醛致癌的分子机 制。本文采用DNA共转染与裸鼠成瘤性分析相结 合的方法，对来自甲醛诱发的大鼠鼻腔癌细胞系 FAT7中的转化序列进行了检测和初步鉴定。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 细胞系、质粒及裸鼠 　　甲醛诱发的大鼠鼻腔癌细胞系FAT7由陈主 初教授在美国化学工业毒理学研究所(Clit)建立 并带回，小鼠成纤维细胞系NIH3T3(CRL―1659) 购自美国典型培养物中心(ATCC)，人膀胱癌细胞 系T24及质粒pkjl?neo由本所保存。裸小鼠 (BALB／Cnu／nu)购自中国科学院上海实验动物 中心。 　　 　　1.2 主要试剂 　　胎牛血清，培养基DMEM、RPMll640均系美 国Hyclone公司产品；分子生物学试剂，如随机引 物标记试剂盒、PCR试剂盒、限制性核酸内切酶、 低熔点琼脂糖等购自美国promega公司；DNA回 收试剂盒为上海生工公司产品；转染试剂Fu- GENTM6和G418购自美国Roche公司；同位素 a-32P-dCTP(3000ci／mm01)购自北京亚辉公司。 其它常用试剂均为国产分析纯。 　　 　　1．3 方法 　　1．3，1 DNA的提取和Southern杂交 　　质粒／真核细胞DNA的提取、酶切、电泳以 及Southem杂交均参照文献的方法，探针回收 和标记则按试剂盒说明书进行。 　　 　　1．3，2 DNA共转染、G418筛选与棵鼠成瘤性 分析 　　转染前24h，接种约5x105NIH3T3细胞于 100mm平皿中培养过夜．转染时，先取3个含有 770 1xL无血清DMEM的聚丙烯酰胺试管，分别 于每管中加入30μL脂质体转染试剂，并轻轻混 匀；同时于另外3个含有800 μL无血清DMEM 的聚丙烯酰胺试管中分别加入FAT7、NIH3T3、 T24细胞基因组DNA各30 ixg和pkj1-neo质粒 DNA各300ng，同样轻轻混匀。再将加入了脂质 体转染试剂的试管分别与加入不同细胞DNA试 管中的液体混合，室温下静置15min。然后，用无 血清DMEM给待转染的细胞换液，并将上述混合 液加入到含有4mL无血清DMEM的细胞培养皿 中，轻轻混匀后置37℃ C02培养箱孵育，6h后，补 加5，6mL含20％胎牛血清的DMEM培养过夜。 　　转染72h后，用胰酶消化转染细胞，并按1：5 传代培养，同时在培养基中加入G418(终浓度为 400mg／L)进行筛选，以后每隔2d换一次筛选培 养基(含G418，300mg／L)。约8～10d左右，转染 细胞出现抗性克隆，而未转染的NIH3T3细胞，筛 选10d后全部死亡。继续筛选1～2周后，每个 平皿中约有300个抗性克隆，此时再用胰酶消化 细胞，并将每组细胞集中(每组抗性克隆数≥1 000)，细胞计数后接种于4周龄裸小鼠(BALB／c nu／nu)右腋窝皮下，(每只0．5 mL，107个细胞)， 当肿块超过1 cm×1cm后，处死荷瘤裸鼠，切下 肿块供进一步分析. 　　 　　1．3．3 PCR扩增及序列分析 　　本研究使用的引物名称、序列及扩增产物大 小见表1。其中，引物3B5U／3B5L针对大鼠特异 性高度重复序列3B5，参照文献设计，用于 Southern杂交的探针标记；N-rasE2U／N-rasE2L用 于检测大鼠N－ras基因外显子2，参照文献设 计：引物H－raselU／H-rasElL和K-rasElU／ K-rasElL，分别用于大鼠H-ras和K-ras基因外显