锌离子转运体slc39a6zip6在斑马鱼造血中的作用-the role of zinc ion transporter slc 39a6 zip 6 in zebrafish hematopoiesis.docxVIP

独创性声明 本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切 法律后果。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。  本论文属于 保密□ ，在 年解密后适用本授权书。 不保密√。  （请在以上方框内打“√” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日  目 录 摘 要1 ABSTRACT 2 前 言4 材料和方法7 结 果18 讨 论22 参考文献26 综述 CRISPR 系统进行基因组编辑的研究进展31 致 谢51 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文  PAGE 9 锌离子转运体 SLC39A6/ZIP6 在斑马鱼造血中的作用 摘 要 【目的】利用基因组编辑技术转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)，建立斑 马鱼锌离子转运体SLC39A6/ZIP6基因靶向敲除模型。在模型基础上，比较基因敲 除技术和敲降的异同。同时，探究SLC39A6/ZIP6基因在斑马鱼造血中的作用，为 深入理解该基因对造血发育及调控提供理论依据，为血液疾病的诊断和治疗提供 选择。 【方法】本研究中，针对锌离子转运体SLC39A6/ZIP6基因设计并构建高效的 TALENs人工核酸酶，T7E1内切酶和T载体克隆法检测切割效率。利用体外转录和 显微注射单细胞受精卵等方法，构建斑马鱼突变体。提取斑马鱼基因组DNA和RNA， PCR扩增、T载体克隆、基因测序和RT-PCR等方法鉴定突变体。整胚胎原位杂交技 术和RT-PCR等检测造血系统各系特异性基因表达水平。锌离子荧光探针检测体内 锌离子分布。 【结果】针对SLC39A6/ZIP6基因的TALENs显示出高效的切割活性，约为23.8%。 同时成功获得一种突变形式的ZIP6基因纯合敲除斑马鱼模型。该模型的表型不同 于吗啉寡聚核苷酸(MO)敲降的结果，而且新发现敲除模型4dpf时出现明显心包水 肿，并且体内锌离子分布异常。检测造血系统各系发育情况，c-myb、lck、rag1 和rag2基因RNA水平表达量减少。 【结论】本研究探索SLC39A6/ZIP6基因的功能，发现基因敲除技术建立的纯合 模型是优于之前瞬时不完全的基因敲降模型，其结果更可信、稳定和全面。同时， 本研究发现锌离子转运体SLC39A6/ZIP6在斑马鱼造血系统发育中，参与调控的造 血干细胞和T细胞形成，是不可或缺的信号分子。 【关键词】 ZIP6 基因组编辑 斑马鱼 造血  Zinc Transporter SLC39A6/ZIP6 Regulates Hematopoiesis in Zebrafish Abstract Objective: By using genome editing technology, transcription activator-like effector nucleases (TALENs),we established ZIP6 gene knock-out zebrafish models. Comparied of gene knock-down results,we wanted to find out the differences between them . And we explored the role of SLC39A6/ZIP6 gene in zebrafish hematopoiesis, for in-depth understanding theoretical basis of the regulation of hematopoietic development and providing options for diagnosis and treatment of blood disorders. Methods: In this study, appropriate target site and TALENs were designed against zebrafish ZIP6 gene. TALENs were constructed via modif