AFLP分子标记发展及应用.doc

AFLP分子标记发展及应用 　　摘 要:扩增片段长度多态性(AFLP) 是一种高效的DNA分子标记技术, 近年来其研究方法和检测技术不断改进和优化,并由此衍生出多种相关技术, 使其在遗传多样性、种质鉴定、遗传图谱构建、基因定位等研究中得到广泛的应用。本文即对AFLP的原理、衍生技术及其应用等进行了介绍。 　　关键词:分子标记技术;AFLP;应用 　　中图分类号:Q503 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2010)05-0010-05 　　 　　 分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段,直接体现基因组DNA 间的差异。在过去30多年,DNA 分子标记得到了迅速发展。扩增片段长度多态性 (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) 技术为第二代分子标记技术,是在随机扩增多态性 (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) 和限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 技术上发展起来的DNA 多态性检测技术,同时拥有RFLP的高重复性和RAPD简便快捷的特点。同其他以PCR 为基础的标记技术相比,AFLP 技术能同时检测到大量的位点和多态性标记,具有覆盖面广、高保真性、高效性、高分辨率、DNA用量少、事先勿需知道序列任何信息、可在全基因组产生标记、标记的分离遵循孟德尔遗传规律等优点,自1995年由Zabeau和Vos[1]创建以来,已在动物、植物和微生物的分子系统学研究中得到应用,具有广阔的发展前景。 　　 　　1 AFLP 标记的基本原理、操作流程及技术关键 　　 　　1.1 AFLP 标记的原理 　　AFLP 标记的原理是对基因组总DNA 酶切后经PCR 进行选择性扩增。先将基因组DNA 用两种限制性内切酶酶切成大小不等的片段,并与含有粘性末端的人工接头相连,形成酶切位点不同的限制性酶切片段,然后用与接头和位点相匹配的引物进行预扩增,预扩增产物作为进一步PCR 扩增的模板,再选用特异引物进行选择性扩增,扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳将特异的限制性片段分离。由于不同来源DNA 的酶切片段存在差异,因而产生了扩增产物的多态性[2]。 　　1.2 操作流程 　　 AFLP 标记的具体操作流程[3]为: ①DNA 提取和质量检测;②双酶切和酶切片段连接;③酶切连接片段的预扩增;④选择性扩增; ⑤扩增产物在聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳; ⑥将电泳后的凝胶进行显影检测及数据分析。 　　1.3 技术关键 　　1.3.1 保证模板DNA 的质量 在制备DNA 的过程中要特别注意避免核酸酶及各种失活物质的污染,基因组DNA OD??260/OD??280的值应为1.8左右。 　　1.3.2 酶切和酶切片段连接中掌握最适时间 时间过长、过短均影响酶切和连接的效果,找到最适时间,既可使酶切和连接彻底,又可提高工作效率。另外,在某些体系中可将酶切和连接两步合为一步进行,以简化反应步骤、缩短反应时间[4,5]。 　　1.3.3 引物、接头的合成及引物的巧妙组合 人工设计合成的通用接头以及与接头序列相匹配的专用引物,使得在事先不知道基因组序列信息的条件下即可进行扩增反应。这个特点使引物之间的搭配存在很大的灵活性,因此引物的正确筛选与巧妙组合显得十分重要。若引物搭配的恰到好处,仅用少数几对引物就可获得大量的遗传信息,既能提高工作效率,又能节约开支[6]。 　　1.3.4 优化反应条件 AFLP 分析对PCR 反应条件要求较高,Mg2+、dNTP 的浓度、Taq 酶量及预扩产物稀释倍数等条件对反应结果的影响尤为显著,需反复摸索确定最适扩增条件[5,6]。 　　 　　2 AFLP的衍生技术 　　 　　AFLP 标记技术自诞生以来在限制性内切酶组合、引物设计、检测方法等方面有了较大改进,并发展衍生了许多相关技术。 　　2.1 单内切酶扩增片段长度多态性技术 (Selective Amplified DNA Fragments, SADF) 　　SADF 技术采用单限制性酶对基因组DNA 或cDNA 进行消化,并且使酶切和连接在同一反应体系中进行,选择性扩增产物在琼脂糖凝胶电泳后即可进行分离检测[7]。对于基因组相对简单的生物,利用单限制性酶进行酶切不仅快速而且重复性好,但对于基因组复杂的生物,由于琼脂糖凝胶的分辨率较低,往往受到一定的限制。 　　2.2 三内切酶扩增片段长度多态性技术 (Three Endonuclease Amplified Fragment Length Polymorphism, TE-AFLP)