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5―脂氧化酶通路在非酒精性脂肪性肝炎中作用和机制 　　[摘要] 目的 探讨5-脂氧化酶（5-LO）通路在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的作用。 方法 将4周龄ApoE-/-雄性小鼠16只随机分为两组：对照组（普通饲料）、NASH模型组（高脂高胆固醇饲料）。连续喂养12周后，肝组织油红染色观察脂肪变，采用HE染色进行NAFLD活动度评分（NAFLD activity score，NAS）。荧光定量RT-PCR检测5-LO、BLT1等mRNA表达，Western Bot法检测5-LO蛋白，酶联免疫法检测肝脏白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）。 结果 高脂高胆固醇饮食12周能诱导ApoE-/-小鼠出现NASH表现，建模成功。NASH模型组较对照组肝组织5-LO mRNA及蛋白表达明显升高（P0.01），肝匀浆LTB4水平[（71.09±18.23）pg/mL vs （46.71±11.71） pg/mL]升高（P0.01），其受体BLT1 mRNA水平显著升高（P0.01），中性粒细胞趋化因子和相应受体MIP2、CXCR2以及黏附分子ICAM1、VCAM1 mRNA的表达均较对照组明显升高（P0.01）。 结论 5-LO炎症通路通过上调中性粒细胞粘附浸润相关因子，诱导中性粒细胞浸润，促进非酒精性脂肪性肝炎进展。 　　[关键词] 5-脂氧化酶；脂肪性肝炎；非酒精性；中性粒细胞 　　[中图分类号] R575 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）28-0035-04 　　随着人们饮食和生活方式的改变，与肥胖和代谢综合征（metabolic syndrome，MetS）相关的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发病率逐年攀升，在普通人群中发病率达30%以上，而在肥胖个体中甚至达到80%以上，严重威胁人类健康[1]。既往研究表明，肝小叶内中性粒细胞[neutrophil，也称多形核白细胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）]浸润是NASH早期的特征性病理改变[2]，但经典TLR4 致炎信号通路激活不能完全解释其发病。新近研究显示，5-LO炎症通路异常激活在MetS相关疾病包括肥胖、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化等疾病中参与系统性慢性低度炎症的形成[3，4]，敲除5-LO 或BLT1 基因可使小鼠异常代谢表型明显减轻[5，6]；但目前相关研究更多集中在外周脂肪组织，这条致炎通路在NASH早期肝小叶内PMNs 浸润过程中作用如何有待进一步研究。本研究利用ApoE基因敲除（ApoE-/-）的高脂高胆固醇饮食诱导NASH小鼠模型，观察该通路异常在NASH早期肝小叶内中性粒细胞浸润过程中的可能作用。 　　1材料与方法 　　1.1 动物模型的建立及取材 　　SPF级4周龄C57BL/6J ApoE-/-雄性小鼠16只（购于南京大学国家遗传工程小鼠资源库），饲养于杭州师范大学动物实验中心SPF级动物房，适应性饲养1周后，随机均分为两组：对照组（n=8）予普通饲料喂养； NASH模型组（n=8）予高脂高胆固醇饲料（D12079B，Reasearch Diet，美国）喂养。连续喂养12周后处死动物，常规采集血清标本，由肝左叶固定部位取材，制备肝脏石蜡切片和冰冻切片，其余肝组织-80℃冷冻保存备用。本研究获杭州师范大学伦理委员会审查通过。 　　1.2肝脏病理学检查 　　肝脏冰冻切片行油红O染色观察肝细胞脂肪变，石蜡切片HE染色观察肝细胞脂肪变性程度、气球样变、小叶内及汇管区炎症程度以计算NAFLD活动度计分（NAFLD activity score，NAS）。 　　1.3 荧光定量RT-PCR 　　取适量肝组织，Trizol法提取总RNA，取总RNA 2 μg采用逆转录试剂盒（Roche）合成cDNA，再将逆转录产物3 μL在荧光定量PCR仪进行PCR扩增，以18S为内参，以2-ΔΔCT比较相关基因的表达水平，各基因引物见表1。 　　1.4 Western Blot 　　取适量肝组织用RIPA裂解液裂解，上清液行蛋白浓度测定后，将等量样品加入5X蛋白上样缓冲液，95℃ 5 min变性。各组蛋白上样50 μg，用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行常规电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温封闭30 min，按1∶1 000 加入兔抗小鼠5-LO（Abcam）一抗及兔抗小鼠β-actin（CST）一抗，4℃孵育过夜。TBST 洗膜3次。按1∶5000加入山羊抗兔IgG（Abcam）二抗，室温孵育1 h，TBST 洗膜3次，化学发光成像系统采集图像并进行分析。 　　1.5肝组织LTB4检测 　　取肝组织15 mg加入生理盐水500 μL进行匀浆，采用SPE（C-18）柱形筒（CAYMAN