esp1基因Teton载体构建及在Hela中可调控性表达.docVIP

esp1基因Teton载体构建及在Hela中可调控性表达 　　摘要：目的构建esp1- pTRE-d2EGFP可调控真核表达载体，检测其在Hela 细胞内的表达情况。方法将esp1导入pTRE-d2EGFP载体中。用脂质体将pTet-on、PTK-Hyg 和esp1-pTRE-d2EGFP共转染入Hela细胞, 以不同浓度的DOX诱导, 用Real-time PCR、Western blot检测esp1表达水平。结果我们构建的可调控性表达载体能在Hela细胞内表达, 不同浓度药物诱导的esp1表达水平明显不同。结论成功构建了esp1- pTRE-d2EGFP真核表达载体, 并可在Hela细胞内表达。为进一步观察esp1与肿瘤发生、发展的关系奠定了基础。 　　关键词：esp1；Hela ；pTet-on；PTK-Hyg ；esp1-pTRE-d2EGFP 　　中图分类号：R392.12 文献标识码：A 　　esp1基因表达一种分离酶(separase) 在遗传信息的传递中发挥重要作用。我们以esp1为靶基因构建一种可调控的真核表达载体, 以实现人为控制的esp1的表达[1，2]。本研究应用Tet-on系统调控esp1的表达，在低于DOX毒性剂量时就可以发挥诱导作用。其可控性、高表达效率和低表达背景特征，已成为研究基因功能、进行疾病基因治疗的有力武器[3]。为将来应用于动物模型, 方便快捷地研究分离酶在肿瘤细胞过度增殖中的机制奠定基础。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料Hela，PSK-esp1质粒，pTet-on、PTK-Hyg 、pTRE-d2EGFP（购自Clontech 公司），DMEM培养基（Hyclone美国），小牛血清（兰州民海生物），Tipure（Roch公司），逆转录试剂盒（Promega公司），PCR试剂（宝生物公司），引物（Invitrogen公司），强力霉素(DOX)（深圳晶美生物有限公司）。 　　1.2方法 　　1.2.1 Tet-on 系统esp1表达调控模型的构建 　　1.2.1.1 esp1目的基因片段的获得载体PSK-esp1质粒用EcoR Ⅰ, Sac Ⅱ双酶，胶纯化回收试剂盒回收纯化6662bp的目的片段。 　　1.2.1.2 esp1-pTRE-d2EGFP质粒的构建利用T4DNA连接酶连入EcoR Ⅰ单酶切后的pTRE-d2EGFP载体，转化入DH5α感受态菌，利用青霉素平板筛选，挑取单个菌落用LB培养基扩增，抽取质粒酶切鉴定，鉴定正确的质粒送上海英骏公司测序验证。 　　1.2.1.3 PTet-on 质粒的转染在转染前将6 孔板中Hela细胞的培养液换为无血清培养液,选择如下转染比率3∶1、3∶2、6∶1;无血清培养基97、97、94μl;转染试剂3、3、6μl 待转染质粒1、2、1μg。最后将混合试剂室温放置15～45min,滴入待转染的已换无血清培养基的细胞中进行转染。转染8h 后换新鲜有血清培养基,转染24h 后加G418 (200ng/ml),筛选2w后挑选单个细胞克隆扩大培养。 　　1.2.1.4 PTK-Hyg 质粒和esp1-pTRE-d2EGFP质粒的共转染将转染pTet-on 质粒成功的Hela细胞克隆传入6孔板,细胞密度为1×105 个/ml。筛选2w后挑选单个细胞克隆扩大培养。 　　1.2.2 Real-time PCR检测DOX诱导下Tet-on 系统调控esp1的表达 　　1.2.2.1 DOX半衰期为24h，有效浓度为100~1000 ng/ml，撤药5d后表达恢复原来水平； 　　1.2.2.2细胞RNA 提取； 　　1.2.2.3 RNA 逆转录 cDNA； 　　1.2.2.4定量PCR反应①构建反应体系；②标准曲线的制作；③数据处理。 　　实验数据用C(T)及拷贝/μl表示，实验组和对照组测得拷贝数均除以各自内参，结果采用SPSS10.0软件独立样本t检验分析，P0.05表示差异具有显著性意义，P0.01表示差异具有非常显著性意义。 　　1.2.3 WB检测强力霉素诱导下Tet-on系统调控分离酶的表达 ①细胞总蛋白的提取；②SDS－PAGE电泳；③转膜；④免疫反应。 　　1.2.4 Hela细胞染色体的制备①细胞生长至覆盖瓶底面积70%时加入秋水仙素，使终浓度为40ng/ml，继续培养1.5h。②弃培养基，用PBS 洗1次，0.25%胰蛋白酶消化细胞，172.5×g离心6min，弃上清。③加入预热至37℃的0.075mol/L低渗液KCl，至10ml，混匀， 37 ℃低渗处理20min，172.5×g离心6min，去上清。④加固定液甲醇-冰醋酸(3:1)至10 ml，混匀，固定30 min，然后172.5×g