pCDNA 3.1 EC―SOD真核载体构建及在巨噬细胞中表达.docVIP

pCDNA 3.1 EC―SOD真核载体构建及在巨噬细胞中表达 　　摘要：目的 为明确EC-SOD在动脉粥样硬化发生发展中的作用，课题组体外构建pCDNA 3.1/EC-SOD真核表达载体，并观察其在THP-1单核源性巨噬细胞中的表达情况。方法 重组质粒经PCR、酶切以及序列分析正确无误后，借助Lipofectamine 2000将转染到THP-1单核源性巨噬细胞中，24h后倒置荧光显微镜下观察转染情况。结果 重组质粒经酶切鉴定、PCR和测序分析后，证实pCDNA 3.1/EC-SOD质粒构建成功。将pCDNA 3.1/EC-SOD通过脂质体转入THP-1单核源性巨噬细胞后，倒置荧光显微镜下观察转染效率。结论 pCDNA 3.1/EC-SOD载体构建成功，并成功在THP-1单核源性巨噬细胞中表达，为研究EC-SOD在动脉粥样硬化发生发展中的作用奠定了基础。 　　关键词：EC-SOD；THP-1单核源性巨噬细胞 　　超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种广泛存在于生物体内的金属酶，是体内重要的抗氧化防御系统，包括铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）、锰超氧化物歧化酶（MnSOD）以及最近日益得到重视的细胞外超氧化物歧化酶（ECSOD）[1]。EC-SOD是Marklund等在1982年发现的一种分泌型糖蛋白，主要由巨噬细胞和血管平滑肌细胞产生，它是惟一分布在细胞外发挥抗氧化作用的酶，对机体的氧化/抗氧化平衡起至关重要的作用[2，3]。EC-SOD可以清除脂质过氧化物、减轻氧自由基对组织细胞的过氧化损伤，并能降低脂质过氧化物形成，从而保护血管内皮免受氧自由基的损伤，防止动脉粥样硬化（Atherosclerosis， AS）的形成[4，5]。为了更深层次的研究EC-SOD的作用机理，我们构建了PcDNA-3.1/EC-SOD真核表达载体，并成功转染了THP-1单核源性巨噬细胞，为进一步研究EC-SOD的作用奠定了基础。 　　1资料与方法 　　1.1主要实验仪器和试剂 大肠杆菌DH5α（北京博迈德生物技术有限公司）；PcDNA-3.1（+）质粒由本实验室保存；DNA 相对分子质量maker、限制性内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ、T4 DNA 连 接 酶（Fermentas公司）；Taq DNA 聚合酶、dNTP （Takara公司）；Lipofectamine2000（Invitrogen公司）；质粒小量制备试剂盒、DNA纯化回收试剂盒（Axygen公司）。HF160W CO2孵箱（上海力申科学仪器技术公司）；CKX31相差显微镜 （OLYPUS公司）；721-型分光光度计（惠普上海分析仪器有限公司产品）。RPMI-1640培养基 （GIBCO.BKI公司）；高速低温离心机 （艾本德公司）；Universal HoodⅡ型凝胶成像系统和酶标仪680 （Bio-Rad公司）；实时荧光定量基因扩增仪FTC-3000 （Funglyn Biotech公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；佛波酯（phorbol myristate acetate， PMA）、同型半胱氨酸、MTT、二甲基亚枫DMSO （Sigma公司）； Trizol（Invitrogen公司），逆转录试剂盒和荧光PCR试剂盒（Fermentas公司），引物由上海生工公司合成。 　　1.2方法 　　1.2.1 THP-1单核源性巨噬细胞的培养 THP-1单核细胞加入含15%胎牛血清的RPMI-1640培养液，于5% CO2、37℃的培养箱中培养，以2×106个/ L接种于培养瓶中，加入浓度为500 μmol/ L的PMA后培养48 h，显微镜下观察细胞贴壁状态和分化情况，证实THP-1单核细胞是否分化为巨噬细胞。 　　1.2.2 EC-SOD基因的PCR扩增 收集培养的巨噬细胞，以提取总RNA作为逆转录模板，以cDNA为模板扩增EC-SOD基因编码区域序列，上游引物：5-CCCAAGCTTATGCTGGCGCTACTG TGTTC-3 （划线处为Hind Ⅲ酶切位点）；下游引物：5-CGGAATTCTCAGGCGGC CTTGCACTCG-3 （划线处为EcoRⅠ酶切位点），产物大小为718bp。反应体系如下：GC Buffer 12.5 L，cDNA 1 L，dNTP 4 L， Taq DNA 聚合酶0.25 L，游引物各0.5 L，6.25 L H2O。PCR反应参数为95℃预变性4 min；94℃变性30 s， 56℃退火30 s， 72℃延伸30s， 扩增35个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。 　　1.2.3 pCDNA 3.1/EC-SOD重组质粒的构建 将PCR产物电泳后回收目的片段。载体质粒