Stomatin样蛋白2通过PI3K通路对儿童哮喘影响.docVIP

Stomatin样蛋白2通过PI3K通路对儿童哮喘影响 　　[摘要] 目的 研究Stomatin样蛋白2（STOML2）基因表达在儿童哮喘发病中的作用。 方法 选择2013年9月～2014年3月在西安市儿童医院（以下简称“我院”）呼吸科住院的14例哮喘患儿为研究对象，选择同期在我院进行健康体检的9例正常儿童作为对照。采用RT-qPCR和Western blot方法检测两组儿童外周血单个核细胞（PBMC）中STOML2和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）mRNA和蛋白的表达水平；构建STOML2过表达载体并转染气道平滑肌细胞（ASMC），MTT法检测细胞的生长，观察STOML2过表达对PI3K表达的影响。 结果 与正常儿童比较，哮喘患儿PBMC中STOML2 mRNA及蛋白水平显著降低，而PI3K水平显著升高，差异均有统计学意义（P 0.05）。体外实验结果显示，过表达STOML2会抑制气道平滑肌细胞生长，并抑制PI3K的表达。 结论 STOML2在哮喘患儿中低表达，过表达STOML2抑制ASMC的生长，其可能是通过抑制PI3K活性实现的。 　　[关键词] 儿童哮喘；Stomatin样蛋白2；磷脂酰肌醇3激酶；气道平滑肌细胞 　　[中图分类号] R562.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）06（b）-0020-05 　　支气管哮喘（简称“哮喘”）是儿童最常见的慢性呼吸道疾病之一。据国际儿童哮喘与变态反应研究（the International Study of Asthma and Allergies in Childhood，ISAAC）统计，全球大约已有3亿例哮喘患者，其中以发展中国家居多[1]。最近的流行学调查结果显示，我国儿童哮喘两年现患率为2.32%，累计患病率为3.02%[2]，消耗着巨大的医疗卫生资源。目前，哮喘的发病机制尚未完全清楚，经典免疫学说认为哮喘的发病机制主要与Th1/Th2功能失衡有关，但其并不能完全解释哮喘的发病。Stomatin样蛋白2（Stomatin-like Protein 2，STOML2）是Stomatin家族的一员，为线粒体内膜蛋白。研究表明，Stomatin在多种癌症中均高表达，进而调控细胞的增殖和迁移[3-4]。陈继承[5]研究发现，人工合成的糖皮质激素――地塞米松，一种治疗儿童哮喘的常用药，可上调人肺腺癌A549细胞和大鼠肺脏中Stomatin的表达，从而增强肺泡上皮细胞膜的稳定性。另一方面，T细胞STOML2的缺失会引起线粒体呼吸的改变及CD4+T细胞应答的缺失[6]，而上调STOML2可促进T细胞分化，发挥免疫调节作用并抑制凋亡[7-8]。这些研究均提示STOML2表达异常可能与哮喘的发病有关。本实验以哮喘患儿为研究对象，构建STOML2过表达载体并将其导入人气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cell，ASMC）中，研究STOML2基因表达在儿童哮喘发病中的作用及其可能的机制。 　　1 对象与方法 　　1.1 对象 　　选取2013年9月～2014年3月在西安市儿童医院（以下简称“我院”）呼吸科就诊的住院患儿作为哮喘组，其中男9例，女5例，年龄5～12，平均（8.2±3.5）岁，哮喘诊断符合中华医学会哮喘诊断标准[9]。选择同期在我院儿童保健科门诊进行健康体检的儿童作为对照组，其中男5例，女4例，年龄6～13，平均（8.2±3.1）岁，均无哮喘疾病家族史，1个月内无呼吸道感染及无过敏性疾病史或其他疾病史。本研究经我院医学伦理委员会批准。 　　1.2 实验材料 　　Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。ASMC购自美国Cambrex Bioscience公司。pCDNA3.1质粒、限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和T4连接酶购自美国NEB公司。大肠杆菌DH5α为我院实验室保存。兔抗人STOML2抗体和PI3Kp85抗体购自Santa Cruz公司。SYBR Premix Ex Taq Ⅱ和反转录试剂盒购自大连宝生物工程公司，MTT试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 标本采集及细胞培养 清晨取研究对象的静脉血5 mL，肝素抗凝。常规分离外周血单个核细胞（PBMC），培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，待用。ASMC也培养于含10%小牛血清的RPMI 1640中。 　　1.3.2 STOML2真核表达载体的构建及分组 根据人STOML2基因全长mRNA序列（序列号为：NM_012999.1）设计STOML2的引物。STOML2上游引物为：5-GTGACTCTCGACAATGTAAC-3，下游引物为：5