七叶皂苷钠对大鼠脑出血后脑组织核转录因子和水通道蛋白作用及相关分析.docVIP

七叶皂苷钠对大鼠脑出血后脑组织核转录因子和水通道蛋白的作用及相关分析 　　[摘要] 目的 探讨七叶皂苷钠对急性脑出血（intracerebral hemorrage，ICH）后核转录因子（NF-κB）和水通道蛋白（AQP）动态表达的影响。 方法 选取健康雄性SD大鼠120只，随机分为假手术组、模型组、七叶皂苷钠组（简称治疗组）3组。每组又分为1、2、3和7 d 4个时间点，每个时间点5只大鼠，采用大鼠尾状核注入自体不凝血制备脑出血模型，大鼠分别在不同时间点断头取脑，采用 Western-blot免疫印迹技术观察NF-κB蛋白表达，免疫组化染色观察AQP-4的变化。 结果 治疗组大鼠脑内NF-κB[（0.293±0.067），（0.441±0.064），（0.263±0.068），（0.258±0.061）]、AQP-4蛋白[（11.57±1.98），（14.27±2.16），（16.83±2.34），（9.82±1.64）]表达在不同时间点，与模型组比较差异均有统计学意义（P 0.05）。相关性分析两者呈正相关（r = 0. 82，P 0.05）。 结论 七叶皂苷钠可以抑制脑出血后NF-κB和AQP-4的表达，减轻脑损伤的程度。 　　[关键词] 脑出血；核转录因子；水通道蛋白4；七叶皂苷钠 　　[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（b）-0019-03 　　脑出血是非外伤性脑实质出血，也是急性脑血管疾病中的急危重症，病死率居急性脑血管病的首位。近来研究显示，脑出血后脑水肿形成可能与免疫炎性反应以及炎症过程中产生的炎症细胞因子有关[1]，而核转录因子（NF-κB）是炎症级联反应的关键物质。脑血肿形成后，脑水肿逐渐加重，促进水通道蛋白4（AQP-4）在脑组织中的表达。本研究旨在观察七叶皂苷钠对脑出血后NF-κB和AQP-4表达的影响探讨其作用机制，为减轻脑出血后水肿提供新的治疗方案[2-3]。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物 　　清洁级SD大鼠，120只，雄性，体重250～300 g，黑龙江中医药大学实验动物中心提供。标准饲料喂养。SD大鼠随机分为假手术组、脑出血组、七叶皂苷钠治疗组，分别按1、2、3、7 d分为4个亚组，每组5只。 　　1.2 试剂与仪器 　　小鼠抗大鼠NF-κB多克隆抗体试剂盒、小鼠抗大鼠AQP-4 单克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司；头颅立体定位仪（Stoelting公司，美国）；微量注射器（宁波市镇江三爱仪器厂）；OLYMPUS光学显微镜（日本）；凝胶图象处理系统（德国）。 　　1.3 脑出血模型的制备 　　大鼠脑出血模型采用立体定位钻孔自体血注入法制备。参照Lee等[4]方法进行改良，将大鼠腹腔注射20%乌拉坦（0.30 mg/100 g）麻醉，固定于脑立体定位仪上，皮肤消毒，剥离骨膜，暴露前囟及冠状缝， （以前囟为定位点，向前0.2 mm，中线右旁开3 mm，深6.0 mm），用牙科钻钻直径为1.0 mm的圆孔，用微量注射器抽取右侧股动脉血50 μL，立即于定位仪上沿钻孔进针，以25 μL/min速度推进尾壳核，留针10 min再缓慢出针，缝合切口并局部皮肤用碘酒消毒。假手术组：尾壳核注射生理盐水5 μL。参照Zausinger等[5]评定法进行神经功能评分，4分以下和大鼠出现不同程度的偏瘫症状为模型成功标准。 　　1.4 治疗方法 　　造模大鼠苏醒后，治疗组立即给予七叶皂苷钠腹腔注射3 mg/（kg·d），每隔12 h给药1次。假手术组、模型组给药时间及给药途径同治疗组，以等量蒸馏水代替药液。 　　1.5 脑组织Western blot法检测 NF-κB表达 　　取血肿周围的100 mg脑组织研磨成粉状，玻璃匀浆器中反复研磨，冰上静置1 h，然后4℃ 12 000 r/min离心20 min，取出上清液Bradford法测定蛋白浓度，-80℃保存用于后续试验。在Tris-甘氨酸缓冲液中电泳，溴酚蓝到达胶的底端附近停止电泳。安装标准电转膜装置，在60 V电压条件下用切好的硝酸纤维素膜进行印迹转移90 min，封闭液封闭，加入小鼠抗大鼠NF-κB（一抗）过夜；次日用TBST在室温下脱色摇床上洗3次；加入二抗稀释液室温下孵育1 h，TBST液清洗3次，DAB显色，β-actin作为内对照利用凝胶成像系统摄像，分析目标带的分子量和积分光密度值，目的蛋白与β-actin积分光密度比值即为目的蛋白的相对表达水平。 　　1.6 免疫组化方法测定 AQP-4 的表达 　　采用免疫组化ABC法进行染色，切片常规脱蜡至水，用3%的H2O2孵育15 min。将切片放于枸橼酸缓冲液中修复15 min。PBS