二甲双胍对LPS诱导THP1细胞所产生相关炎症因子影响.docVIP

二甲双胍对LPS诱导THP1细胞所产生的相关炎症因子的影响 　　摘要:目的通过反转录聚合酶链反应（RTPCR）技术，检测在二甲双胍(Met)及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的阻断剂复合物 C（compound C）干预下，脂多糖(LPS)诱导的人单核细胞（THP1）相关炎症因子白介素1β（IL1β）、肿瘤坏死因子（TNFα）基因水平的表达，探讨Met的抗炎作用及抗炎机制。方法体外培养人单核细胞，并分为对照组，LPS组（1 μg/mLLPS），Met组（Met 5 mmol/L+ LPS 1 μg/mL），复合物C组（Met 5 mmol/L+ LPS 1 μg/mL+compound C 10 μmol/L）分别孵育6 h后，提取细胞进行检测。台盼蓝染色镜下计数观察细胞存活率。RTPCR检测细胞炎症因子IL1β、TNFα的表达水平。结果Met在干预6 h后，可降低LPS所诱导的THP1细胞的炎症因子IL1β、TNFα的基因表达。 Met组炎症因子IL1β、TNFα的分泌显著低于LPS组（P0.01）。复合物C组炎症因子IL1β、TNFα较Met组表达增加（P0.01）。结论Met干预6 h可降低LPS诱导的THP1细胞相关炎症因子IL1β、TNFα的基因表达，提示二甲双胍在基因水平上有一定的抗炎作用，且其抗炎途径与激活AMPK有关。 　　关键词：二甲双胍；人单核细胞；苷酸活化蛋白激酶；炎症因子 　　 中图分类号：R587.1R255.4文献标识码：Adoi:10.3969/j.issn2014.06.050文章编号2014 　　 　　2型糖尿病是一种慢性炎症性疾病［1，2］，低度炎症与肥胖、2型糖尿病有一定的相关性［3］。促炎症因子白介素1β（IL1β）、肿瘤坏死因子（TNFα）等与胰岛素抵抗及代谢综合征密切相关［4］，是糖尿病及其部分慢性并发症的发病基础，故控制相关炎症因子的产生对疾病的治疗有重要的临床价值。二甲双胍(Metformin，Met)作为临床上治疗2型糖尿病的一线用药，不仅可以降低血糖、血脂，减轻体重，增强胰岛素敏感性，还具有一定的抗炎［5］、抗氧化作用。 　　脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）为革兰氏阴性细菌外璧层中一种特有的化学成分，可以刺激单核细胞产生IL1β、TNFα等细胞炎症因子，诱导炎症与氧化应激。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPactivated protein kinase,AMPK) 主要参与调节蛋白质、糖、脂肪等多种代谢过程。有研究显示AMPK 激活后可显著减轻炎症介质的表达及组织的炎症损伤，而复合物C作为AMPK的阻断剂可阻断其抗炎效应。本研究拟通过体外培养人单核细胞（THP1），利用LPS刺激THP1细胞建立炎症模型，并行Met、复合物C干预，观察单核细胞相关炎症因子IL1β、TNFα的基因表达变化，探讨Met可否通过调控基因表达来达到抗炎作用。 　　1材料与方法 　　1.1材料人单核细胞系THP1（上海细胞库）；RPMI1640培养基（赛默飞世尔生物化学制品有限公司）；无支原体胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；盐酸二甲双胍（Sigma公司）；复合物C（Biovision公司）；IL1β、TNFα、βactin引物（上海生工生物工程有限公司）； RTPCR试剂盒（上海生工生物工程有限公司）。 　　1.2THP1细胞系的培养THP1细胞系常规培养在含10%的胎牛血清及1%青链霉素双抗的RPMI1640培养基中，并置于温度为37 ℃，CO2浓度为5%的湿润孵育箱中培养。每3 d～4 d换液一次。 　　1.3台盼蓝染色观察细胞存活率取对数期THP1细胞悬液10 μL,加入90 μL培养基及100 μL台盼蓝染料，混匀后显微镜下观察计数，存活率90%时，方可进行下一步实验。 　　1.4RTPCR检测炎症因子IL1β、TNFα的基因表达取对数期细胞，以1×106的浓度接种于24孔板，设置对照组，LPS组（1 μg/mL），Met组（Met 5 mmol/L+ LPS 1 μg/mL），复合物C组（Met 5 mmol/L+ LPS 1 μg/mL+复合物C 10 μmol/L）分别培养6 h，并收集相应组的细胞。用RTPCR技术进行检测。每组重复实验3次。 　　1.5统计学处理采用SPSS18.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，满足方差齐性时用LSDt法进行两两比较，不满足则采用Nemenyi法进行两两比较，以P0.05为差异有统计学意义。 　　2结果 　　2.1THP1单核细胞的存活率台盼蓝染色后，镜下观察细胞，活细胞呈无色透明状，而