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乳铁蛋白对原代大鼠成骨细胞IGFBP―3、IGFBP―4、IGFBP―5 mRNA表达的影响 　　[摘要] 目的 研究乳铁蛋白对原代大鼠成骨细胞胰岛素生长因子结合蛋白-3（IGFBP-3）、胰岛素生长因子结合蛋白-4（IGFBP-4）、胰岛素生长因子结合蛋白-5（IGFBP-5）mRNA表达的影响。 方法 用混合酶消化法分离大鼠颅骨成骨细胞，进行原代培养。细胞以6×103/cm2接种于六孔板内，用不同浓度乳铁蛋白即0 μg/ml（对照组）、0.1 μg/ml（乳铁蛋白1组）、1 μg/ml（乳铁蛋白2组）、10 μg/ml（乳铁蛋白3组）、100 μg/ml（乳铁蛋白4组）、1000 μg/ml（乳铁蛋白5组）干预原代大鼠成骨细胞1、3、5、7 d后提取总RNA，采用荧光定量PCR技术分析IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表达。 结果 与对照组比较，各浓度组及时间段对IGFBP-3 mRNA表达的影响不稳定，时高时低。与对照组比较，除了乳铁蛋白1组外，其他浓度对IGFBP-4 mRNA的表达呈浓度梯度的抑制（P0.01）。与对照组比较，实验干预第1天，呈浓度梯度抑制IGFBP-5 mRNA的表达（P0.01），乳铁蛋白4、5组在第5、7天表现为继续抑制（P0.01），而其他时间及浓度对IGFBP-5 mRNA的表达调控不稳定。 结论 乳铁蛋白影响原代大鼠成骨细胞IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表达，其中乳铁蛋白对IGFBP-3、IGFBP-5 mRNA表达的调控不稳定，而乳铁蛋白抑制IGFBP-4 mRNA的表达呈浓度依赖性，浓度越高抑制作用越强。 　　[关键词] 乳铁蛋白；成骨细胞；胰岛素生长因子结合蛋白-3；胰岛素生长因子结合蛋白-4；胰岛素生长因子结合蛋白-5 　　[中图分类号] R329.2+4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（b）-0004-05 　　乳铁蛋白是一种分子量为80 kDa的铁结合蛋白，属于转铁蛋白家族，主要存在于母乳、中性粒细胞及其次级颗粒中[1]。正常情况下，乳铁蛋白在体内的浓度为2×106～6×106 g/ml[2]，具有免疫调节、抑菌抗炎等作用，是一种多效应因子[3-4]。近年来，乳铁蛋白被发现具有促进成骨细胞增殖和骨生长的作用。除了胰岛素样生长因子结合蛋白1（insulin-like growth factor binding protein 1，IGFBP-1），成骨细胞表达IGFBP-2～6，它们是六种同源异构物[5]。大量相似的研究发现，成骨的增殖和骨形成受胰岛素生长因子结合蛋白的调控，其中IGFBP-3，4，5很可能是发挥作用的关键因子。本研究通过不同浓度乳铁蛋白作用于原代鼠成骨细胞1、3、5、7 d后用实时荧光定量PCR检测大鼠成骨细胞IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表达，以探讨乳铁蛋白影响成骨细胞增殖及与IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5之间的关系机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　出生24 h内的SD乳鼠（吴氏动物），牛源乳铁蛋白（恒天然 Fonterra，纯度90%），胎牛血清（GIBCO），DMEM（GIBCO），0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO），双抗（青霉素、链霉素，Hyclon公司），碱性磷酸酶染色试剂盒（南京建成生物公司），SABC免疫组织化学试剂盒（武汉博士德公司），Ⅰ型胶原酶（Invitrogen）DMSO（GIBCO），TRIZOL（美国Invitrogen公司），RNAiso Plus（TAKARA），Primescript RT reagent kit（TAKARA：DRR037A），dH2O，引物（TAKARA），SYBR？? Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time）（Takara Code：DRR081），反转录仪（Takara），实时荧光定量PCR仪（Takara），紫外分光光度计（NanoDrop ND-1000）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 原代大鼠成骨细胞的培养 　　取出生24 h内的SD乳鼠6只，颈部脱臼处死消毒，剪下头颅浸泡于75%乙醇5 min。将头颅置于装有PBS的培养皿中，剔除颅骨的结缔组织及其骨膜。用PBS冲洗骨片至发白后将其剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织片。3 ml 0.25%胰酶（含EDTA）磁粒子37℃恒温搅拌15 min，去上清后加入0.25%胰酶和Ⅰ型胶原酶（1 ml∶4 ml）混合物，再次37℃恒温搅拌消化60 min。取上清，1000 r/min离心10 min后弃上清。取10%完全培养液6 ml重悬，