二苯乙烯苷对脂肪变性HEPG2细胞影响实验研究.docVIP

二苯乙烯苷对脂肪变性HEPG2细胞影响的实验研究 　　摘要：目的 建立油酸诱导脂肪肝离体细胞模型，考察二苯乙烯苷对其干预效果及相关机制。方法 以离体人肝癌HepG2细胞为研究对象，以随机对照方式进行研究。实验一：用0.7mM、1.4mM、2.8mM三种不同浓度油酸和10%（V/V）胎牛血清的RPMI-1640完全培养基孵育HepG2细胞24h，制备肝细胞脂肪变性模型。油红O染色观察每组细胞形态和细胞内脂滴的形成情况，分别检测细胞内甘油三酯的含量，确定油酸造模的最佳作用浓度。实验二：实验分为6组：第1组为空白组，即正常肝细胞组；第2组为模型组，即脂变肝细胞组；第3组至第6组在脂变细胞中分别加入不等量二苯乙烯苷，使二苯乙烯苷终浓度分别为2uM、4uM、8uM和16uM。每组加药后继续孵育24h。油红O染色观察每组细胞形态和细胞内脂滴的形成情况，检测细胞内甘油三酯、总蛋白的含量，培养基中ALT、AST含量。实验三：实时定量RT-PCR法检测每组肝细胞乙酰CoA羧化酶mRNA水平的表达。实验数据以 表示，用SPSS13.0统计软件对数据进行分析，P0.05）。③RT-PCR显示肝细胞脂肪变性后ACC mRNA表达增强，加入二苯乙烯苷处理后ACC mRNA表达明显减弱。结论 ①1.4mM油酸为制造脂肪变性HepG2细胞模型的最适浓度。②二苯乙烯苷能减少肝细胞内甘油三酯沉积，且与二苯乙烯苷浓度呈剂量依赖性关系。③二苯乙烯苷能改善肝脏病理形态，改善肝功能指标。④二苯乙烯苷能抑制HepG2细胞中ACCmRNA的表达。 　　关键词：二苯乙烯苷；脂肪变性肝细胞；甘油三酯；ACCmRNA 　　非酒精性脂肪肝（NAFL） 与肥胖、高血压病、糖尿病、高脂血症等代谢综合征密切相关，是以肝细胞脂肪变性为主的临床病理综合征。目前国内外对何首乌的调制作用[1]，及二苯乙烯苷研究机理[2]多有研究。本实验采用了实时定量RT-PCR法检测了脂变人肝HepG2细胞的ACCmRNA表达，结果表明：二苯乙烯苷可能通过抑制ACCmRNA的表达而减少脂肪酸的合成，使肝细胞内TG沉积减少，减轻肝细胞脂肪变性，可达到治疗非酒精性脂肪性肝脏疾病的目的。 　　1临床资料 　　1.1细胞来源 人胚肝癌HepG2细胞株来源于中国科学院上海细胞库，本实验所用细胞株为第14～16代。 　　1.2主要试剂 ①PRMI1640培养基（美国GIBCO公司）；②HEPES（美国Sigma公司）；③胎牛血清（美国GBICO公司）；④胰蛋白酶（美国Sigma公司）；⑤油酸（美国Sigma公司）；⑥DMSO（美国Sigma公司）；⑦油红O、苏木素（美国Sigma公司）；⑧MTT（美国Sigma公司）；⑨Western及IP细胞裂解液（碧云天生物技术研究所）；⑩甘油三酯试剂盒（中生北控生物研究所）；○11考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）；○12二苯乙烯苷标准品（中国药品生物制品检定所）；○13ALT、AST试剂盒（中生北控生物研究所）；○14二苯乙烯苷标准品（中国药品生物制品检定所）；○15RNAiso Plus（宝生物）；○16氯仿；○17异丙醇；○1875%乙醇（DEPC处理水配制）；○191st Strand CDNA （宝生物）；○20SYBRR Premix Ex TaqTM （Perfect Real Time）（200次量）。 　　1.3主要仪器 ①倒置相差显微镜（德国Leica公司；②CO2恒温培养箱（美国Thermo公司）；③恒温水浴箱（北京长安科学仪器厂）；④低温高速离心机（美国Beckman公司）；⑤台式高速离心机（德国Hermle公司）；⑥超净工作台（北京半导体设备一厂）；⑦-80℃低温冰箱（日本Sanyo公司）；⑧多功能读板机（美国Molecular Devices公司）；⑨7300实时定量PCR仪（美国ABI公司）；⑩EXPRESS PCR仪（美国Hybrid公司）。 　　2实验方法 　　2.1细胞株培养、冻存、复苏遵循常规无菌操作原则 　　2.2 MTT比色实验 将HepG2细胞培养于96孔板，分别加入含不同浓度油酸的培养基培养24h，用MTT比色法测定细胞活力，选择既对细胞有一定伤害，又不会使细胞裂解死亡的浓度作为诱导细胞形成脂肪肝的最适浓度。 　　2.2.1 实验分组 共分7组，每组6复孔：①空白组；②0.05%DMSO组；③0.1%DMSO组；④0.2%DMSO组；⑤0.7mM油酸组；⑥1.4mM油酸组；⑦2.8mM油酸组。 　　2.2.2实验步骤 ①接种细胞：常规接种。②同步：将培养板放入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及饱和湿度下培养24h，待细胞铺满孔底面积的80%左右时换用无血清1640液，以终止细胞生长。③加药：2