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发菜总RNA提取方法比较与优化 　　摘要：发菜是一种具有丰富胶质鞘、色素、多糖的陆生蓝藻。采用Omega RNA提取试剂盒、Trizol RNA提取法、天根试剂盒及优化后的Omega RNA提取试剂盒、Trizol法、天根试剂盒法从发菜藻体中提取RNA，并用核酸浓度测定仪和琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA质量。结果表明，优化前后的Trizol法均无法提取到发菜总RNA；利用Omega试剂盒获得发菜总RNA已降解；利用天根试剂盒可获得发菜总RNA，进一步改进和优化天根试剂盒的提取程序，获得的发菜总RNA 23S、16S条带清晰，D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm分别为2.06、2.08。研究结果为深入开展发菜转录组研究奠定了基础。 　　关键词：发菜；总RNA；提取；方法优化 　　中图分类号：Q781文献标志码：A文章编号：1002-1302（2015）09-0058-03 　　收稿日期：2014-08-22 　　基金项目：国家自然科学基金（编号。 　　简介作者：杨佳（1988―），女，山东菏泽人，硕士研究生，主要从事资源植物学方面的研究。E-mail：yangjia713@126.com。 　　通信作者：梁文裕，博士，教授，主要从事植物资源及植物分子生物学的研究。E-mail：liangwy2009@163.com。生物体性状和对外界环境的响应归根到底是由基因调控的，基因调控主要涉及到核酸、蛋白质等生物分子，高质量RNA是进行基因表达分析的基础。细胞内RNA分子多样性和易被降解的特性决定了RNA提取过程的复杂性[1]，RNA酶高稳定性是造成RNA分离困难的主要原因。RNA提取过程中出现的RNA酶有2种来源：外源性RNA酶和内源性RNA酶。外源RNA来自RNA制备过程中用到的玻璃和塑料制品、研究人员本身以及分离过程中用到的试剂或溶液，但这些外源性RNA酶可以通过RNA酶抑制剂处理或使用RNA研究的专用试剂等措施来解决[2-4]。而内源性RNA酶存在于材料本身，如材料的不新鲜会降低RNA的产量，破碎细胞内含物常与RNA形成难溶的物质（多糖类等）导致RNA分离困难[5-6]，因此，诸多因素会直接影响RNA的提取效果，增加RNA的提取难度。 　　发菜（Nostoc flagelliforme）是一种陆生固氮蓝藻，生长在干旱-半干旱荒漠草原地区，具有独特的抗干旱、高温、高光照度、紫外线等非生物胁迫的特性[7]。RNA提取是探索发菜抗逆差异基因表达或转录组研究的重要基础，但由于发菜藻体被较厚的胶质鞘包被，对发菜藻体和细胞的破碎存在一定难度，同时发菜藻体富含的多糖、色素、蛋白质等会以不同方式干扰RNA的提取，从而加大了发菜藻体RNA提取的难度。目前，国内尚无发菜高质量RNA提取的相关报道，找到适合提取发菜总RNA的方法具有重要意义。本研究对3种发菜藻体RNA的提取方法进行比较和优化，筛选出最适合发菜RNA的提取方法，为从抗逆差异基因表达或转录组角度研究发菜耐干旱、抗紫外辐射等机理奠定重要基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　野生新鲜发菜采自宁夏贺兰山发菜自然生长地。 　　1.2发菜藻体总RNA的提取及优化 　　1.2.1Omega试剂盒法提取发菜藻体总RNA将研磨充分的发菜藻体粉末转入Buffer RCL中（含β-巯基乙醇），迅速涡旋振荡，使材料充分裂解，按Omega公司E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit试剂盒说明书中的E.Z.N.A.TM Plant RNA Protocol Ⅱ进行试验。 　　1.2.2Trizol法提取发菜藻体总RNA按照TRIzol Reagent说明书进行发菜藻体RNA的提取。 　　1.2.3天根试剂盒法提取发菜RNA将充分研磨至粉末的发菜藻体迅速转移至裂解液SL（含β-巯基乙醇）中，立即涡旋剧烈振荡混匀，按天根公司RNAprep Pure Plant Kit试剂盒步骤提取发菜藻体总RNA。 　　1.3发菜藻体总RNA提取方法的优化 　　1.3.1Omega试剂盒方法的优化参照Omega试剂盒法稍作修改。使用700 μL Buffer RCL进行材料的裂解。试验步骤中增加DNase I，即当RNA全部吸附到HiBindTM RNA Mini柱子上后，加300 μL RWC Wash Buffer到柱子上，10 000 g离心1 min，把配好的DNase Ⅰ mix准确地加入柱子中心，室温静置15 min；将HiBindTM RNA Mini柱子放入1个新的收集管中，加400 μL RWC Wash Buffer，静置5 min，10 000 g离心 1 min；最后加入在70 ℃水中孵育的DEPC水进行RNA的