第五章 农药残留的酶与免疫测定技术.docVIP

PAGE PAGE 166 第五章 农药残留的酶与免疫测定技术 随着生命科学、环境科学、新材料等科学的发展，以及生物学、信息科学、计算机技术的引入，使分析化学进入新的境界，如分析研究对象越来越多的选择了DNA、蛋白质、手性药物和环境毒物等与生命活动相关的物质；分析研究体系由简单转向复杂体系；分析研究层次已进入了单细胞、单分子水平和立体构象，分析研究方法除发展各类仪器分析手段之外，开始较多的研究酶和免疫学等生物化学方法。农药残留分析领域的发展趋势无疑与整个分析化学的发展趋势相一致。 为适应市场的需求，满足贸易的时效，保护消费者健康的迫切要求，促进了政府和科技工作者开发农药残留快速检测方法，即使用现场快速检测方法对日益增长的大量样本进行初步筛选，然后再采用标准的方法进行测定。近年来，随着人们对食品安全和环境质量的要求越来越高，生物测定技术以其简单、快速、灵敏、特异性强、样品量少而得到迅速发展，应用酶技术、酶联免疫技术、PCR技术、基因差异显示技术、生物传感器、基因探针、生物芯片等现代生物技术测定农药残留，已成为国内外科学工作者研究的热点。但是目前的测定方法如酶抑制法、免疫分析法只能达到定性和半定量的水平，还无法取代常规气相色谱和高效液相色谱方法，快速检测方法还需要继续完善，使之标准化。 5.1 酶抑制分析测定法 蔬菜中的农药残留问题近年来引起了政府的关注，同时也成为舆论焦点。但是蔬菜是种特殊的农产品，其保鲜期很短，如果采用常规的检测方法，没等检测完毕，蔬菜就已经失去了食用价值，另外这类农产品农药残留问题较多、较严重，易引发急性中毒事件，因此用于检测蔬菜、水果等有机磷、氨基甲酸酯类农药残留酶抑制分析速测技术便应运而生。 5.1.1 酶法概述 早在1951年，Giang与Hall应用有机磷和氨基甲酸酯农药在体外对胆碱酯酶具有抑制作用的机理，来测定其含量。1975年Kramer与Gamson用一种与靛酚乙酸酯相似的化合物，测定1～10μg的各种有机磷酸酯化合物，与此同时Zweig等也测定了甲萘威等农药。1968年，Mendoza等利用薄层——酶抑制技术测定10种有机磷和氨基甲酸酯农药，最小检出量可达到ng水平，并作为一种经典方法被广泛采用。进入80年代，人们开始以来源丰富、取材和制备都十分方便的植物酶源，建立薄层一植物酯酶抑制方法，为酶抑制法的进一步推广和应用创造了条件。 近年来，酶抑制技术进入了开发速测与应用的新阶段。美国堪萨斯一研究所（Midwest Research Institute, MRI）开发出一种称为农药检测器的“酶标签”（Engyme Tichet），这种酶标签对乙酰胆碱酯酶（AChE）的抑制灵敏，可用于测定水中有机磷和氨基甲酸酯农药，检测限在0.1～10mg/L。其快速、简便，可以在田间或其他没有仪器的地方使用。中国台湾农业试验所利用敏感的家蝇脑AChE建立生化法（即酶法）并研制出与此法相匹配的专用分光光度计，带有专用软件及打印机，用于测定蔬菜中的有机磷和氨基甲酸酯类农药，灵敏度为mg/kg级。1987年，中国农业部环保科研所研制出农药残毒速测箱，其原理就是根据有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂对动物和昆虫的毒理作用是通过特异性抑制胆碱酯酶来实现的，近年来华南农业大学、上海昆虫研究所、上海交通大学也先后研制出简易、快速检测有机磷农药的酶片和生色基质片，灵敏度在0.1～10mg/kg，适用于现场实测。 5.1.2 酶法检测原理 有机磷和氨基甲酸酯类农药，都是神经毒剂，对参与神经生理传递过程的乙酰胆碱酯酶AChE具有抑制作用，使该酶的分解作用不能正常进行，从而导致底物乙酰胆碱的积累，影响动物正常的神经传导，引起中毒或死亡。研究工作者将这一昆虫毒理学原理应用到农药残留检测中，如果农产品样品提取液中不含有或含有很低的有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就不被抑制，试样中加入的基质就被酶水解，或少部分水解，水解产物与加入的显色剂反应产生颜色；反之，如果试样提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就被抑制，试样中加入的基质就不能被酶水解，从而不显色或颜色很浅，用分光光度计测定吸光度值，计算出抑制率，就可以判断出样品中农药残留情况。 AChE属于丝氨酸为中心的酶类，羧酸酯酶（非特异性酯酶的一种）与AChE类似，同样以丝氨酸残基作为活动中心，因此对AChE有抑制作用的有机磷和氨基甲酸酯类农药同样对羧酸酯酶有抑制作用，因此，依据其对AChE或羧酸酯酶作用的有无或大小，即可判断有机磷或氨基甲酸酯类农药的有无或含量多少。基本检测原理可以简单概括如下： 样本加酶 样本加酶 酶活性被抑 酶活性正常 底物不被水解 底物被水解 加显色剂不显色 加显色剂显色 含有机磷或氨基甲酸酯类农药 不含有机磷或氨基甲酸酯类农药 近年来投向市场