Th17细胞亚群在支气管哮喘中的发病机制及TLR2对Th17细胞分化的调控研究-内科学(呼吸系病)专业论文.docxVIP

华中科技大学博士学位论文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 10 PAGE 10 中文摘要 第一部分 Th17 和 Tc17 细胞亚群及其细胞因子白介素 17 在哮喘小鼠动 物模型中的表达研究 【目的】探讨辅助性 T 细胞 17（Th17）和 CD8+IL-17+细胞（Tc17）在支气管哮喘小 鼠中的比例变化及其意义。 【方法】24 只 BABL/c 小鼠随机分成两组：哮喘组和正常对照组，每组 12 只，用卵 蛋白（OVA）致敏和激发的方法建立小鼠哮喘模型。然后用流式细胞术检测脾脏单个 核细胞中 Th17 细胞和 Tc17 细胞所占的百分比；用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测 支气管肺泡灌洗液中细胞因子 IL-17 的水平；双标免疫荧光检测肺组织中 Th17 细胞 和 Tc17 细胞的表达。 【结果】哮喘组肺组织炎症改变明显；哮喘组脾脏细胞中 Th17 细胞比例显著高于对 照组(P＜0.0001)， Tc17 细胞比例也显著高于对照组(P＜0.001)；哮喘组 BALF 中 IL-17 水平显著高于正常对照组(P＜0.001)；哮喘组 BAL 中细胞总数和嗜酸性粒细胞 数目明显高于对照组(P＜0.01)；肺组织免疫荧光结果示 Th17 细胞和 Tc17 细胞在哮 喘小鼠的肺部有表达，主要分布在支气管周围和血管周围，并且数量明显高于对照组 (P＜0.01)。 【结论】 哮喘小鼠的 Th17 细胞和 Tc17 细胞数量增多，并且分泌的细胞因子 IL-17 水平升高，而且哮喘小鼠肺部有较多的 Th17 细胞和 Tc17 细胞浸润，提示 Th17 细胞 和 Tc17 细胞可能参与了哮喘的发病机制。 【关键词】哮喘；Th17 细胞；Tc17 细胞；白介素 17（IL-17） 第二部分 Toll 样受体 2 信号对小鼠淋巴瘤 EL4 细胞系表达白细胞介素 （IL）-17 影响的研究 【目的】探讨 TLR2 信号通路对小鼠淋巴瘤细胞系 EL4 细胞表达分泌 IL-17A 的影响。 【方法】用 ELISA 法检测各组细胞上清液中 IL-17A 表达水平，实时荧光定量 RT-PCR 法检测各组细胞中 RORγt 和 IL-17A 的 mRNA 的表达水平变化。 【结果】TLR2 配体可以显著增加细胞 IL-17A 和 RORγt 和 IL-17A 的 mRNA 的表达， 而 TLR2 抗体可以将这种促进作用抵消一部分，TLR2 配体刺激后细胞上清 中 IL-17A 蛋白水平也明显升高。 【结论】 Toll 样受体 2 信号对小鼠淋巴瘤 EL4 细胞系表达 IL-17 是起促进作用的， 这种作用可能是通过促进转录因子 RORγt 的表达来实现的。 【关键词】辅助性 T 细胞 17；Toll 样受体 2 ；EL4 细胞 第三部分 Toll 样受体 2 信号激活对 Th17 细胞分化和功能的影响研究 【目的】探讨 Toll 样受体 2 信号在调节 Th17 细胞的分化和功能方面的作用，并且初 步探讨参与调控的信号通路机制。 【方法】制作小鼠哮喘模型，免疫磁珠分选 CD4+T 细胞经体外诱导分化成 Th17 细胞， 细胞分为四组：（1）空白对照组，（2）用 TLR2 的配体（LTA）激活 TLR2 信号组，（3） TLR2 的抗体阻断 TLR2 信号组，（4）RORc 基因的干扰慢病毒组。然后 MTT 法检测 各组的细胞增殖情况，流式细胞仪检测各组胞内因子 IL-17A 的水平，ELISA 检测各 组的细胞上清液中的 IL-17A 蛋白水平，Real-time RT-PCR 检测各组的 Th17 相关细胞 因子（IL-17A、IL-17F 和 IL-22）的 mRNA 水平，并检测转录因子 RORγt 的 mRNA 水平的变化。 【结果】（1）MTT 检测结果示，LTA、LTA+TLR2 抗体和 LTA+慢病毒都能增加 Th17 细胞的增殖，与空白对照组比较，P 值的大小分别为 P＜0.05，P＜0.001 和 P＜0.01。 （2）实时荧光定量 PCR 结果表明慢病毒感染细胞后可使 RORc 的 mRNA 水平下降 86%，各组的 Th17 相关基因 mRNA 水平检测， LTA 组引起 IL-17A、IL-17F 和 IL-22 的 mRNA 水平明显升高(P＜0.05)，LTA+TLR2 抗体组和 LTA+慢病毒组上述升高效应 又被逆转(P＜0.05)。（3）蛋白水平检测胞内因子染色流式分析 LTA 可以明显刺激增加 IL-17A+细胞的百分比，IL-17A+CD8-%由 11.7%增加到 22.5%(P＜0.05)。ELISA 检测 细胞上清中的 IL-17A 结果为 LTA 组引起 IL-17A 蛋白水平增