Toll样受体4对哮喘气道平滑肌细胞的合成分泌及增殖凋亡的作用分析-内科学专业论文.docxVIP

Toll 样受体 4 对哮喘气道平滑肌细胞的合成分 泌及增殖凋亡的作用研究 中文 摘要 研究背景和目的 支气管哮喘（简称哮喘）（bronchial asthma）是由多种细胞 （如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T 淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等） 和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。其重要的病理特征是慢性气道炎 症和气道重构。慢性炎症是以多细胞及细胞组分参与的免疫反应；气道重 构以气道平滑肌细胞（Airway smooth muscle cells, ASMCs）增生肥大、粘 液腺增生、基底膜增厚、粘膜化生和新生血管的增生等为特征；但目前气 道炎症和气道重构的机制未完全明确。近年的研究表明：气道平滑肌细胞 不仅作为靶细胞参与气道重构，还作为免疫细胞参与气道炎症反应，因此， 气道平滑肌细胞在哮喘的发生、发展过程中起着重要作用。 Toll 样受体（Toll like receptors, TLRs）是一个新发现的高度保守而古老 的天然免疫受体家族，它介导固有免疫和获得性免疫，可促使多种炎症因 子和细胞因子释放，引发和加重炎症反应。国外的研究报道 Toll 样受体 4 （Toll like receptors 4，TLR4）在气道平滑肌细胞有表达，同时也证实外周 血单核细胞与正常气道平滑肌细胞共同培养条件下，Toll 样受体 2（Toll like receptors 2，TLR2）及 TLR4 配体可诱导气道平滑肌细胞产生、释放细胞因 子、趋化因子，但国内未见 TLRs 与气道平滑肌细胞关系的研究报道；而且 国外的研究仅局限于正常气道平滑肌细胞表面 TLRs 激活与其分泌功能的 关系并未涉及哮喘状态下气道平滑肌细胞的 TLRs 的作用研究。 Sraat 等人证实了激活 TLR4 可以促进血管平滑肌细胞的增殖，气道平 滑肌细胞和血管平滑肌细胞都属于平滑肌细胞，在形态和功能上非常相似， 因此，我们推测哮喘气道炎症中的众多炎症介质、细胞因子可激活 ASMCs I II II 细胞膜上的 TLRs，TLRs 结合不同配体诱导哮喘气道平滑肌细胞产生炎症 反应、释放炎症介质及促进细胞增殖、抑制凋亡，从而在哮喘的发生、发 展过程中起重要作用。 NF-ΚB 是一种重要的、多向性的核转录因子，普遍存在于细胞质中的 快速反应转录因子，位于 TLRs 下游信号通路的枢纽位置参与免疫反应及细 胞增殖与分化等过程。 哮喘治疗指南推荐糖皮质激素作为首选治疗气道炎症，地塞米松是一 经典的糖皮质激素抗炎药，但其作用机制未明，因此，我们选用地塞米松 治疗哮喘大鼠，探讨 TLR4/NF-ΚB 对哮喘大鼠气道重构的影响。 综上所述，我们将建立大鼠哮喘模型，取肺组织，用图象分析软件测 量气道壁厚度，分离气道平滑肌细胞进行细胞培养、利用 RNAi 技术这一基 因沉默技术将 TLR4 基因沉默以及 RT-PCR、Western blot、TUNNEL、ELISA 等方法探讨 TLR4 对哮喘状态下气道平滑肌细胞的合成分泌功能及增殖凋 亡的影响。为哮喘气道炎症和气道重构的发生机制提供新的理论，为寻找 支气管哮喘治疗的新药物和新靶点奠定基础。 方法 本课题采用细胞培养、siRNA 干扰技术、脂质体转染法、免疫组织化 学染色、免疫细胞化学染色、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Western 印 迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)法、四甲基偶氮唑盐(MTT)微量比色法及 TUNNEL 等检测方法，用肿瘤坏死因子-α（Tumor necosis factor-α,TNF- α）、NF-кB 抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)作为工具药，对体外培 养的哮喘大鼠气道平滑肌细胞中 TLR4 调控细胞增殖和凋亡、合成分泌功能 及 TLR4 表达进行研究；本课题还通过建立大鼠哮喘模型，采用 Western 印 迹检测 TLR4 的蛋白表达水平、RT-PCR 等方法检测 TLR4 的 mRNA 表达水 平，免疫组织化学染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)、凋亡调节蛋白 Bcl-2 的表达水平，通过图像分析系统测定支气管壁厚度(WA/pi)、支气管壁平滑 肌厚度(平滑肌面积/pi)、支气管壁平滑肌细胞核数量(N/pi)，对 TLR4 在哮 III III 喘大鼠气道平滑肌重构中的作用进行研究。 1.结果 (1) 哮喘组 ASMCs 增殖反应明显高于正常组（P0.01）；哮喘组 ASMCs 培 养上清中 IL-5、IL-8 的蛋白含量明显高于正常组（P0.01）。 siRNA-TLR4 转染哮喘大鼠气道平滑肌细胞的最佳时间为 24h。 结果 siRNA-TLR4 转染组的 ASMCs 增殖反应显著低于对照组 (P0.05)；TNF- α组 ASMCs 增殖反应显著高于对照组、siRNA-