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活体小鼠中单个红细胞拉曼光谱分析 　　摘 要 应用拉曼光谱与光镊技术对活体小鼠毛细动脉和静脉血管中的全血以及毛细血管中的红细胞和体外的全血及单个红细胞进行研究；光谱分析显示，可以获得活体血液的拉曼光谱；在动脉毛细管和静脉毛细管中可以观察到清晰的携氧与去氧血液的不同光谱；体内血管中血红细胞的血红蛋白浓度比体外的更高，在动脉毛细管中的血红细胞的携氧态特征峰明显，且具有统计学差异；动脉毛细血管中的pH值比静脉毛细血管中的pH值更高。通过对1604 cm－1特征峰在活体毛细血管中携氧态和去氧态红细胞光谱差异的研究发现，1604 cm－1特征峰的变化与红细胞所处的环境的pH值有关，当环境pH值变大，1604 cm－1特征峰的强度减小；当环境的pH值变小时，1604 cm－1特征峰的强度变大。以上结果表明，在活体中研究血液及单个红细胞的信息变化是可以实现的，同时表明拉曼光谱与光镊技术是一种进行活体中单个细胞研究的强有力的工具。 　　关键词 拉曼光谱； 单个红细胞； 活体 　　 　　1 引 言?? 　　红细胞是血液的重要组成部分，其主要功能是将氧从肺部携带到全身组织，并将二氧化碳从组织携带到肺部，排出体外。红细胞的运氧功能是依靠血红蛋白（Hb）分子实现的。目前，对红细胞中血红蛋白的研究较多。?? 　　由于拉曼光谱具有高敏感、反应快和无损等优点，已经大量应用在单细胞和组织分子组分的研究中。激光光镊拉曼光谱技术是将拉曼光谱与光镊技术结合，用于对溶液中的细胞进行无损监测的一种技术。将此技术应用于红细胞功能的研究较多。Wood等进行了红细胞携氧态和去氧态光谱差异研究，为了解红细胞的最基本的运氧功能及诊断有关红细胞疾病提供了依据。但这些研究都是在体外模拟活体环境进行的，无法模拟体内真正的生理条件。Ivo等对活体小鼠肠膜上血管中的血液进行了共焦拉曼分析，在不破坏血管壁的条件下，获得了血液携氧和去氧光谱信息，应用共焦拉曼光谱技术对生理条件下单个微血管中血液携氧能力进行评估。但此研究只是对流动血液进行比较分析，不能获得单个血红细胞信息，并存在光谱积分时间较长的缺陷。在实验中，虽然未对血管造成破坏，但是由于实验需取出小鼠肠膜，实验操作复杂，准备时间较长。?? 　　本研究采用激光光镊拉曼光谱技术获得活体小鼠耳朵血液系统中正流动血液的拉曼光谱，及动脉毛细血管和静脉毛细血管中被光镊囚禁的单个红细胞的拉曼光谱。研究表明了激光光镊拉曼光谱技术对活体中红细胞研究的优势及其在活体研究中的可行性。 　　2 实验部分 　　2.1 实验装置?? 　　本实验所用的激光光镊拉曼光谱仪的装置图如图1c所示。图1a为从显微镜观察到的血红细胞在血管中流动的图像。实验小鼠麻醉后固定在载物台上，将小鼠耳朵紧贴在载玻片上，如图1b所示。半导体激光器（DL740-201S-Sanyo Laser Diode）产生一束波长为780 nm的激光，滤波后导入倒置生物显微镜（TE2000-U, Nikon）的物镜（100×, NA＝1.3），聚焦到被选定的毛细血管内。从被捕获的细胞散射的拉曼光聚焦到光谱仪的入射狭缝。光谱仪（SpectraPro2300i, Acton）的衍射光栅参量是闪耀波长650 nm，600线/mm。光谱仪耦合到电荷耦合器件CCD（PIXIS 100BR, Princeton Instruments）上，用液氮将CCD冷却到－120 ℃。为了分辨血管的位置，本实验使用LED灯（560 nm）照射小鼠耳朵，并通过CCD摄像机拍照。光谱分辨率为6 cm－1。适合本实验的小鼠耳朵中血管深2.2 样品准备?? 　　实验动物为4～5周龄的SPF级KM雄性小鼠，重量为25～35 g。用4%水合氯醛腹肌注射麻醉（0.1 mL/10 g）。为了便于比较，体外红细胞是从小鼠尾巴取血，以1∶10000的比例溶在0.9%生理盐水中。 　　2.3 数据处理?? 　　进显微镜前激光功率为15 mW，激光光斑大小为2 　　 m。将激光定位在正流动的血液上积分时间为10 s，采集流动血液的拉曼光谱。血液的背景光谱是用小型止血钳夹住耳朵后减慢血液流速后，取得的空血管的光谱。其余光谱都是在光谱积分时间为5 s的条件下取得的。在活体动脉、静脉毛细血管中和在体外生理盐水中都是分别取得20个红细胞的拉曼光谱之后取平均值。单个细胞的光谱是在细胞被捕获后立即收集。活体中背景光谱是在没有红细胞流过时取得的空血管的拉曼光谱，体外背景光谱是在生理盐水中未捕获细胞时取得的。光谱数据的处理过程包括减背景、5点平滑、基线校正和求平均，所有数据的处理都是在Origin8.0软件中进行的。 　　3 结果与讨论 　　3.1 活体与体外全血拉曼光谱比较?? 　　图2中a～c分别是活体中两种不同的毛细血管中流动