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局部应用血管内皮生长因子及骨髓间充质干细胞对超比例随意皮瓣成活率影响 　　[摘要] 目的 研究血管内皮生长因子（VEGF）及人骨髓间充质干细胞（MSC）联合应用对超比例随意皮瓣成活率的影响。方法 采用密度梯度离心法和贴壁筛选法分离、培养人MSC，鉴定其纯度及生物学特性。40只Wistar大鼠随机分成空白对照组、VEGF组、MSC组、MSC+VEGF联合应用组，每只大鼠背部设计2 cm×5 cm带蒂皮瓣，术后连续14 d观察皮瓣愈合情况。术后第14天处死各组动物，计算皮瓣成活百分率；切取距蒂部4 cm处皮瓣行组织学检查，观察远蒂端皮瓣的微血管数量。结果 1）经流式细胞术和成脂、成骨诱导方法鉴定，本研究分离并培养的MSC具有多向分化潜能。2）经临床观察，各组大鼠均未出现免疫排斥反应。空白对照组、VEGF组、MSC组、MSC+VEGF组动物的皮瓣成活百分率分别为55.4%±4.4%、70.7%±6.3%、65.1%±7.1%、93.4%±9.4%，3个实验组皮瓣成活百分率均高于空白对照组（P0.05），MSC+VEGF组成活百分率最高，高于其他3组，差异均有统计学意义（P0.05）。3）组织学检查可见：与其他3组相比，MSC+VEGF组的肉芽组织最为丰富，成纤维细胞多，新生毛细血管最多。结论 1）采用贴壁筛选法和密度梯度离心法结合的方法可以得到纯化且具有多向分化潜能的MSC；2）人MSC具有无免疫 　　反应性或免疫反应性低的特点，跨物种应用不会引起免疫排斥反应；3）VEGF和MSC联合应用具有协同作用，可在短期内重建缺血区域的血液循环，解决超比例皮瓣的远蒂端缺血问题，提高皮瓣成活率和创面组织的修复质量。 　　[关键词] 血管内皮生长因子； 骨髓间充质干细胞； 皮瓣 　　[中图分类号] R 782.2 [文献标志码] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.020 　　血管内皮生长因子（vascular endothelial growth 　　factor，VEGF）是一种可被大多数细胞分泌的糖蛋白二聚体分子[1]，相对分子质量为3.4×104～4.5×104，可通过生成细胞间隙而增加内皮细胞的通透性。VEGF也是主要的低氧诱导性血管生成因子[2]，可通过自分 　　泌和旁分泌作用，刺激血管内皮细胞有丝分裂并增加血管内皮细胞的渗透性以促进血管生成，进而起到促进组织愈合的作用。骨髓间充质干细胞（bone 　　marrow mesenchymal stem cell，MSC）是存在于骨髓中的具有多种分化潜能的干细胞，增殖迅速，并具有低免疫原性的特点，能在特定的条件下向所有起源于中胚层的细胞分化。本研究根据VEGF和人MSC的生物学特性，将二者联合应用，观察二者对超比例随意皮瓣成活率的影响。 　　1 材料和方法 　　1.1 MSC的分离、培养和鉴定 　　无菌条件下取人骨髓血2～5 mL，与等量L-DMEM培养液混合，1 000 r·min-1离心8 min使细胞形成微团。弃去上清及脂肪层，再用L-DMEM培养液重悬细胞，以等体积比轻轻叠加在分离液Percoll（质量浓度1.073 g·mL-1）的液面上，2 500 r·min-1离心30 min。离心后，抽取培养液与分离液液面之间的单个核细胞层，加入L-DMEM培养液冲洗，1 200 r·min-1离心8 min，再用含10%胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞并计数，以每毫升3×106～4×106个细胞的密度接种在24孔板中，37 ℃、5%CO2全湿度条件下培养24～48 h，换液去除未贴壁的悬浮细胞，继续培养，每隔3～4 d换液1次。待原代培养细胞接近汇合（汇合度大于80%）时，弃去培养液，加入胰酶消化细胞。当细胞体收缩间隙变大，加入含10%胎牛血清培养液终止消化，吸取细胞悬液离心洗涤，800 r·min-1离心 　　8 min，培养液重悬细胞，以1∶3比例扩增培养，此为第1代细胞。以相同方法培养细胞并传代，依次为第2、3代，直至第12代。分别取第3、4代细胞，采用流式细胞术检测其表面标志。 　　取3代以上细胞行成脂、成骨诱导，鉴定培养的MSC的生物学特性。成脂诱导方法：将细胞按每孔1×105个细胞接种于六孔板，标准培养液培养24 h后换用含10%胎牛血清的DMEM培养液，并加入地塞米松1 μmol·L-1、吲哚美辛200 μmol·L-1、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX） 　　0.5 mmol·L-1、胰岛素10 μg·mL-1，每3 d半量换液，共诱导2周；诱导后弃去培养液用PBS洗1遍，加入12%中性甲醛溶液固定5 min，加入油红O染液染色30 min，60%甲醛脱色数秒