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扫描离子电导显微镜微探针性能评价 　　摘 要：扫描离子电导显微镜技术是纳米生物医学领域新近发展起来的一种扫描探针显微镜技术，可被用来在生理条件下、高分辨率及非接触地研究活细胞的表面形貌。扫描用玻璃微探针的性能直接影响扫描探针显微镜的分辨率和拓扑成像质量，因此玻璃微探针的制备在实现纳米生物样品的高分辨率探测中具有重要的意义。文章运用扫描电子显微镜直接观测玻璃微探针的几何形状进而推算电阻值，借助膜片钳技术测量微探针实际电阻，并通过应用该种玻璃探针对标准样品进行扫描成像来判断该微探针是否满足实验需要，最终综合上述数据对纳米尺度玻璃微探针的性能进行评价。 　　关键词：扫描离子电导显微镜；纳米技术；玻璃微探针 　　扫描离子电导显微镜（Scanning Ion Conductance Microscopy，SICM）凭借探针跳跃的非接触扫描方式成为了目前最适合在生理液态环境中实时观察活体生物样品表面三维拓扑形貌的一种极具应用前景的扫描探针显微镜技术[1，2]。它采用交流调制式负反馈控制技术和超纳米精度的压电陶瓷控制玻璃微探针在样品表面以恒定距离扫描，记录玻璃微探针的运动轨迹即可获得样品表面三维形貌[3]。因此，作为SICM感知样品表面的唯一工具，玻璃微探针针尖的性能成为决定显微镜分辨率的关键性因素。 　　本文中我们对激光熔拉法拉[4]制出的玻璃微探针进行了高分辨率扫描电镜观测，获得探针形态与针尖尺度参数，通过公式计算与膜片钳实测针尖电阻的方法来评价制备出的纳米玻璃微探针的性能。 　　1 微探针性能在扫描离子电导显微镜技术中的重要性 　　微探针是SICM进行纳米尺度扫描成像的重要探测工具，其性能的优劣直接影响SICM的成像质量。此外，不同的扫描对象和扫描环境条件也对微探针针尖的曲率半径和纵横比等性状提出了不同的要求。因此，对微探针的性能进行评价就显得十分必要。 　　SICM玻璃微探针尖端的几何形状与采集到的数据的真实性密切相关。如图1所示，当对台阶状区域进行探测时，圆形针尖成像得到的是圆滑台阶（图1a）；锥形针尖成像得到的是倾斜台阶（图1b）；当针尖的锥度大于样品的微观尺寸时，由于针尖的曲率半径相对较大，不仅无法准确探测样品的表面形貌（图1c）；而且还会产生横向的位移误差（图1d）；针尖的曲率半径越小，锥度越小，测量结果将越接近样品的真实形貌（图1e）。因此，为了提高测量结果的精度，在探针制备时，应尽量选择小曲率半径和小锥度的微探针。 　　SICM微探针是由硅酸盐玻璃或石英玻璃微管（外径1.00mm， 内径0.59mm）拉制而成的纤细的玻璃微探针，也称为玻璃微电极，为了方便向探针针尖内充灌液体一般玻璃微管内含导液丝（图2）。借助扫描电镜对玻璃微探针针尖的横截面进行成像可以清晰地观察到玻璃微管中的导液丝。导液丝是一根玻璃纤维原丝，而每根原丝又由成百上千根单丝组成，它利用毛细现象的引流作用使得液体更容易注入针尖而不形成气泡。 　　为了描述的方便，研究人员往往把玻璃微探针人为地分成三个部分，如图3所示，为普通光学显微镜下观察到的玻璃微探针。左侧红框中是探针的尖部，中间的红框是探针的颈部，右侧的红框是探针的肩部。因为SICM的分辨率与玻璃微探针尖端内径尺寸为同一数量级，要达到50-100纳米的高分辨率，相应的玻璃微探针尖部的内径尺寸应在同样尺度。探针的肩部应具有良好的轴对称性，如果探针的对称性不好，会使得探针不是垂直于被测样品之上，导致探针的定位与扫描产生误差，直接影响负反馈控制的灵敏性。此外，为了减少针尖的振动增加扫描时的稳定性，探针的颈部也要尽可能短以增加玻璃探针的刚度。 　　简而言之，一支好的SICM微探针应具备以下四点：第一，探针针尖的粗细要满足分辨率的要求；第二，探针要有大的锥角；第三，探针的肩部要轴对称；第四，探针的颈部要尽可能短。 　　2 微探针的扫描电镜观测与电阻测量 　　我们使用美国Sutter Instrument P-2000型程控水平激光微电极拉制仪拉制硼硅酸盐或石英玻璃微电极毛细管来制备SICM微探针。为了检测该玻璃微探针尖端内径尺寸是否达到了50-100 nm，是否具备良好几何形态，我们将拉制好的玻璃微探针进行喷金处理后，用导电胶带粘到载物台上，借助LEO1530VP 型扫描电镜直接观测玻璃微探针针尖的形状。 　　扫描电镜成像得到的玻璃微探针成像显示探针针尖形状对称（图4），利用扫描电镜分析软件测量出玻璃微探针尖端内半径（ri）为27nm，外半径（ro）为60nm （图4A、B）。该玻璃微探针的内壁半角θ为2.7°。通过下面的玻璃微探针电阻计算公式，可以估算出该玻璃微探针在充灌电极内液后的理论电阻值。 　　公式中：Rp为玻璃微探针电阻，ξ为玻璃微探针内液（0.15mol/L KCl）的电导率