猪带绦虫六钩蚴tsol18基因密码子优化真核载体的构建及其在体内 外表达的实验分析-construction of eukaryotic vector optimized by codon of taenia solium tsol 18 gene and experimental analysis of its expression in vivo and in vitro.docxVIP

安徽医科大学硕士学位论文 安徽医科大学硕士学位论文 1 1 中英文术语对照表 英文 中文 pVAX1 空质粒载体 E．col i 大肠杆菌 OD 吸光度 bp 碱基对 Bam HI 限制性内切酶 Hi nd Ⅲ 限制性内切酶 Pr i mer 引物 dNTP 三磷酸脱氧核糖核苷 Tr i s 三羟甲基氨基甲烷 Kana 丁胺卡那霉素 PBS 磷酸盐缓冲盐水 NBS 新生牛血清 RT- PCR 逆转录- 聚合酶链反应 DMSO 二甲基亚砜 SDS- PAGE 十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶 电泳 West er n bl ott i ng 免疫印迹 DAB 辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺 I gG 免疫球蛋白 G PAGE PAGE 10 猪带绦虫六钩蚴 TSOL18 基因密码子优化真核表达载体 的构建及其在体内、外表达的实验研究 1 引 言 猪囊尾蚴病是猪带绦虫的幼虫——囊尾蚴引起，呈全球性分布，已经成为发展 中国家的一个重要的公共卫生问题，在我国近年来(九五、十五计划)的防治寄生虫 病规划中，都把其列入重点防治对象之一。囊尾蚴主要在人体和猪体产生寄生性 疾病，其中，在人体的不同部位均能引起各种类型的囊尾蚴病（俗称囊虫病），严 重危害广大人民的身体健康[1]。囊尾蚴的感染是由于宿主吞食了猪带绦虫虫卵，或 已有成虫在消化道寄生的绦虫病患者其自体肠道内消化了孕节后，虫卵在十二指 肠内经消化液的作用，24~72 小时后胚膜破裂，六钩蚴逸出，然后借其小钩和分泌 物的作用，钻入小肠壁，经血液循环或淋巴系统而到达宿主身体各处，尤以皮下 肌肉、脑组织和眼部多见。在寄生部位，虫体逐渐发育增大，中间细胞液化形成 空腔，充满液体，约经 10 周，猪囊尾蚴发育成熟。我国是世界范围内囊尾蚴病的 高发地区之一[2]，据 2000 年的统计，在我国 29 个省（区、市）的 675 个县有囊尾 蚴病的流行，这给畜牧业带来了很大的经济损失，并严重地威胁着人们的健康[3]。 囊虫病传统上以药物治疗为主，考虑到药物残留及环境安全的威胁，随着分子生 物学和免疫学等学科发展，人们把目光投向安全、有效的疫苗研制和开发。为了 防治囊尾蚴病，国内外已经研究构建了多种不同类型的囊尾蚴病疫苗，由起初的 虫体疫苗、蛋白疫苗发展为细胞疫苗、抗独特型抗体疫苗，乃至基因疫苗[4~6]。近 年来，在疫苗研制方面，尤其在制备囊尾蚴病的重组蛋白疫苗和核酸疫苗方面取 得了较大进展。随着寄生虫分子生物学和免疫学等与疫苗开发相关学科研究的深 入，用免疫化学分析方法鉴定保护性抗原，应用重组 DNA 等分子生物学技术进行 新型疫苗研究成为可能。猪带绦虫的六钩蚴及其分泌物是一种有效的免疫资源 [7~9]，国外学者在寻找猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原及其抗体表达方面作了相关的 研究[9]。多年来，在猪囊尾蚴基因工程苗的研制、诊断方法的建立等方面，TSOL18 基因得到了众多研究人员的关注[10~12]。已有研究证明无论是 TSOL18 重组抗原还是 六钩蚴全虫体的免疫血清均能在体外试验中杀死六钩蚴[13]，是猪囊尾蚴病的重要 疫苗候选抗原之一。TSOL18 作为一种预防疫苗对阻止链状带绦虫在中间宿主中的 感染有着非常大的潜在价值，已有的研究提示 TSOL18 及其重组疫苗能很好地抵抗 猪带绦虫卵的攻击，同时也能降低猪囊尾蚴病的发病率。DNA 疫苗是将病原体内编 码具有保护性抗原作用的基因，通过载体进入宿主细胞并期望能够在宿主细胞内 高效表达该基因。病原体与感染宿主间在密码子使用方面的差异，可影响抗原基 因的有效表达及其诱导的免疫保护作用, 这就成了 DNA 疫苗发展的一个重要的障 碍。因此，为了提高 DNA 疫苗的保护效果，拟对保护性抗原的基因的密码子进行 优化，增加抗原的表达量，刺激宿主产生较强的免疫应答，产生更高的保护力。 为了进一步研制出更加有效的囊尾蚴病疫苗，本实验把 TSOL18 基因片段进行密码 子优化改造设计并成功连接在 PVAX1 载体上，构建出猪带绦虫六钩蚴期特异性基 因重组质粒：优化 PVAX1/ TSOL18。将优化 PVAX1/ TSOL18 经脂质体 LI POFECTAMI NE 2000 介导转入 CHO-K1 细胞中并检测其表达情况，为研究密码子优化 PVAX1/ TSOL18 的效应机制及猪带绦虫六钩蚴期 DNA 疫苗在宿主体内的表达奠定一 定的实验条件与依据。同时经骨骼肌将优化和未优化的重组质粒注入昆明种小鼠， 以抗六钩蚴兔血清及羊抗兔 I gG 进行免疫组化实验，观察和探讨重组 DNA 疫苗在 宿主体内的表达，旨在为进一步在体验证其保护性和今后大规模的在体试验奠定 基础。 2 材料与方法 2. 1 实验材料 2. 1.